摘要
目的 探究虾青素对小鼠压力性损伤创面的修复作用。方法 体外实验:用不同浓度虾青素处理成纤维细胞,通过 CCK-8实验检测细胞的增殖活性。随后通过缺氧/复氧诱导成纤维细胞损伤,给予最适浓度虾青素,用DHE荧光探针检测细胞内活性氧水平,RT-qPCR检测细胞内 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β 的 mRNA表达。体内实验:将两块圆形磁铁对称吸附于小鼠皮肤两侧,5 h后移除磁铁,以构建压力性损伤模型。随后分组灌胃等量的生理盐水、低剂量虾青素(10 mg/kg)与高剂量虾青素(20 mg/kg),定期采集创面图像。治疗7 d后,统计创面愈合率,并采集创面组织进行组织病理学染色。结果 体外:应用虾青素后,缺氧/复氧损伤成纤维细胞内DHE荧光强度显著降低,TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平明显下调,TGF-β、IL-10 mRNA表达显著上调(P<0.05)。体内:高剂量虾青素组创面愈合率显著提高,DHE荧光强度显著降低,创面组织TNF-α、IL-6明显减少,TGF-β、IL-10明显增多(P<0.05)。结论 虾青素可显著改善氧化应激,减轻炎症反应,对压力性损伤创面具有保护作用。
关键词:
虾青素
抗氧化剂
压力性损伤
缺血-再灌注
缺氧/复氧损伤
压力性损伤旧称“压疮”“褥疮”,是指压力或压力联合剪切力引起的局部皮肤或皮下组织损伤,多见于围术期或术后固定、慢性消耗性疾病和神经系统疾病等患者的骨突部位(如肩胛骨、骶尾骨和跟骨等) 。此处通常为着力点,且肌肉附着较少,缺乏肌肉与脂肪的保护作用,因此,受压后持续缺血缺氧、代谢障碍,最终变性坏死 。压力性损伤愈合困难,治疗周期长,严重影响患者的生活质量。
压力性损伤的核心病理机制是外力施加-解除循环所引起的组织缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤 。其导致创面难以愈合的潜在机制包括氧化应激、炎症系统过度激活、线粒体失调、细胞凋亡等 ,而氧化应激和炎症反应作为其中的关键机制,在组织损伤后发生的过度级联反应中起到重要作用 。因此,靶向氧化应激,减轻炎症反应的药物可能成为治疗压力性损伤的理想药物。
虾青素(astaxanthin,AST)是一种从藻类、酵母或细菌中提取的酮式类胡萝卜素,化学名为3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素,分子式为C 40 H 52 O 4 ,其化学结构是4个异戊二烯单位以共轭双键相连,两端由2个异戊二烯单位组成的六节环结构 。研究发现其化学结构中的共轭双键能够将自由基转化为更稳定的产物,中断自由基链式反应,从而发挥强抗氧化的作用 。此外,特殊的化学结构使其能够跨越细胞膜,同时清除细胞表面和磷脂膜内部的自由基,故其抗氧化活性远远强于其他类胡萝卜素。研究表明,虾青素的抗氧化活性是叶黄素、β-胡萝卜素和花青素的10倍,是维生素E的100倍 。此外,虾青素还具有抗炎、抗凋亡等特性,具有保护心肌细胞、神经细胞和感光器细胞等药理作用,故本文推测虾青素可能具有修复压力性损伤创面的潜在应用价值 [9-10] 。
为探究虾青素对压力性损伤创面是否具有保护作用,本文通过磁铁循环压迫-释放的方式构建小鼠压力性损伤模型,并通过缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)诱导成纤维细胞损伤,探究虾青素对压力性损伤创面和 H/R 损伤成纤维细胞的影响。
1 . 1 . 1 细胞、药物与试剂 成纤维细胞系 NIH3T3 购自中国科学院细胞库;DMEM 高糖培养基购自美国Hylcone公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;虾青素购于上海麦克林生化科技有限公司;反转录试剂盒购自日本Takara公司;qPCR SYBR Green Master Mix 购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;引物由上海华津生物科技有限公司合成;CCK-8试剂盒、活性氧检测试剂盒(DHE荧光探针法)购自上海碧云天生物技术股份有限公司;TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β一抗购自英国 Abcam公司。
1 . 1 . 2 实验动物 用于构建压力性损伤模型的SPF级雄性C57BL/6J小鼠购自上海吉辉实验动物饲养有限公司,7～8周龄,平均体重23 g,饲养于上海交通大学医学院附属新华医院实验动物中心,饲养条件:温度(22±2)℃,相对湿度(50±10)%,12 h 交替照明,实验期间小鼠自由进食进水。实验动物使用许可证号SYXK(沪)2023-0048。实验方案已通过上海交通大学医学院附属新华医院动物伦理委员会审查批准(批准编号 XHEC-F-2024-055)。
1 . 1 . 3 主要仪器 圆形磁铁(直径12 mm,厚5 mm,质量2.4 g,磁通量0.2 mWb)购自深圳市鑫弘昌磁材有限公司;CO 2 细胞培养箱、NanoDrop 2000分光光度计、Applied Biosystems PCR热循环仪购自美国Thermo Fisher公司;高速低温离心机、移液器购自德国 Eppendorf公司;多功能酶标仪购自美国Bio-Tek公司;石蜡包埋机、切片机、普通光学显微镜购自德国Leica公司;倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司。
1 . 2 . 1 NIH 3 T 3 细胞培养 将细胞接种于细胞培养皿或培养板上,加入含10%胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基),置于37 ℃、5%CO 2 培养箱内培养。
1 . 2 . 2 缺氧/复氧损伤细胞模型构建 通过 H/R诱导成纤维细胞损伤模型,以模拟压力性损伤部位成纤维细胞的生长环境,即将细胞培养至贴壁,除去旧培养基,更换为无血清培养基,在37 ℃含94% N 2 、5%CO 2 、1%O 2 气体的低氧培养箱中缺氧培养12 h。随后将无血清培养基更换完全培养基,在正常培养箱中复氧培养3 h。H/R期间,给药组根据不同实验分组在培养基中添加不同浓度的虾青素,对照组和模型组不作给药处理。
1 . 2 . 3 CCK-8法检测细胞增殖活性 将细胞以5 000个/孔密度接种于96孔板内,同时设置空白孔,每组5个复孔,于37 ℃、5%CO 2 培养箱培养。待细胞贴壁后弃上清,加入用培养基稀释的虾青素(质量浓度分别为25、50、100、200 μmol/L),继续培养24 h后吸去上清,每孔添加100 μL经无血清培养基稀释的10% CCK-8试剂,操作过程中避免产生气泡。于37 ℃培养箱内孵育30 min后,采用酶标仪检测孔板在450 nm波长处的吸光度值(OD值)。
1 . 2 . 4 超氧化物阴离子荧光探针检测细胞内活性氧含量 将细胞接种于24孔板内,在37 ℃、5% CO 2 培养箱培养 24 h后按上述方法分组处理(对照组、模型组和虾青素组)。检测前吸弃培养基,加入经无血清培养基稀释的DHE溶液,37 ℃孵育30 min,PBS漂洗3次,于荧光显微镜下观察各组细胞染色情况,随机挑选3个视野采集图像。
1 . 2 . 5 实时荧光定量聚合酶链式反应检测炎症因子水平 将细胞接种至6 孔板内,分组处理各组细胞(对照组、模型组和虾青素组),通过TRIzol一步法提取各组细胞总RNA,采用NanoDrop 2000分光光度计测定总RNA浓度。利用PrimeScrip RT 试剂盒从总质量为1 μg的RNA中提取 cDNA。采用 SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus)在Quant Studio3 Real-time PCR系统中进行测定。反应条件:95℃ 预变性5 min;95 ℃ 变性 10 s,60 ℃退火 20 s,75 ℃延伸 20 s(40个循环)。使用 GAPDH 作为内参对各组RNA 水平进行标准化处理,以 2 -ΔΔCt 法计算各基因的相对表达量,引物序列见 表1
1 . 2 . 6 压力性损伤模型构建 采用磁铁对局部皮肤循环加压-释放模拟组织缺血-再灌注过程,以构建压力性损伤创面。每个循环包括5 h缺血期和19 h再灌注期,以受压部位变黑、硬痂形成为造模成功标准。具体操作过程如下:取18只C57BL/6J小鼠,用脱毛膏除去背部毛发,提起裸露的皮肤,将两块圆形磁铁对称吸附于皮肤两侧,对局部皮肤产生的压强约为40 kPa。每天压迫5 h后移除磁铁,连续进行5 d的加压-释放循环。造模过程中小鼠单笼饲养,自由进食进水。
1 . 2 . 7 分组干预 将造模成功的小鼠随机分为3组:模型组、低剂量组和高剂量组,每组6只。将虾青素粉末经二甲亚砜(DMSO)溶解,使用生理盐水稀释。模型组每天灌胃生理盐水(含DMSO),低、高剂量组分别按10、20 mg/kg虾青素剂量进行灌胃,1次/d,连续7 d。
1 . 2 . 8 创面愈合情况观察 给药后定期观察创面愈合情况,于第1、3、7天对创面进行拍照,拍照时在创面周围放置钢尺,通过 Image J软件计算创面面积,统计创面愈合率:
创面愈合率=(初始创面面积-各时间点创面面积)/初始创面面积×100%
1 . 2 . 9 创面病理形态观察 于治疗后第7天通过颈椎脱臼法处死各组小鼠,剪下创面皮肤组织,保存于4%多聚甲醛中,经乙醇脱水、石蜡包埋等步骤后,制作成5 μm厚的组织切片,分别进行HE和Masson染色,于显微镜下观察创面组织形态及胶原合成情况。
1 . 2 . 10 免疫组化染色 按上述方法制备创面组织切片,进行炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β)免疫组化染色。将切片脱蜡、水化,经抗原修复、封闭后,加入一抗4 ℃孵育过夜。隔天经PBS洗涤后加入二抗,37 ℃孵育30 min,用DAB显色,苏木精复染,用中性树胶封固后在光学显微镜下进行观察,棕黄色为阳性表达。每张切片随机选取3个视野,观察各组创面组织的炎症因子表达情况。
1 . 2 . 11 创面组织超氧化物阴离子荧光染色 将剪下的创面皮肤组织经液氮冷冻后保存于-80 ℃冰箱内,制作成 10 μm 厚的冰冻切片,滴加适当浓度的DHE染色工作液,37 ℃孵育30 min,于荧光显微镜下进行观察,每张随机选取3个视野进行拍照,并通过Image J软件分析相对荧光强度,比较各组皮肤组织内活性氧含量。
1 . 2 . 12 统计学方法 所有实验均重复3次,结果以(均值±标准差)表示。采用Graphpad Prism 10.0软件进行统计学分析,两组间比较用 t 检验, P <0.05表示差异具有统计学意义。
2 . 1 . 1 虾青素对 NIH3T3 细胞增殖活性的影响 细胞经不同浓度的虾青素处理后24 h,读取在450 nm处的吸光度值。结果显示,当虾青素质量浓度在50 μmol/L以下时,细胞的增殖活性无明显变化(见 图1 )。后续根据此实验结果,选用质量浓度为50 μmol/L的虾青素进行实验。
2 . 1 . 2 虾青素对H/R 损伤细胞内氧化应激的影响 DHE荧光呈红色,反映细胞内ROS水平。H/R模型组细胞内DHE荧光强度明显高于对照组,而虾青素组荧光强度较H/R组显著降低( P <0.05)。该结果提示,虾青素可显著改善成纤维细胞缺氧/复氧损伤后氧化应激(见 图2 )。
2 . 1 . 3 虾青素对H/R损伤细胞内炎症反应的影响 比较实时荧光定量PCR结果发现,与正常对照组相比,H/R模型组细胞内促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)mRNA表达水平显著升高,使用虾青素后,促炎因子mRNA水平明显降低。H/R模型组细胞内抗炎因子(TGF-β、IL-10)mRNA表达水平较对照组降低,应用虾青素后,抗炎因子水平明显升高( P <0.05)。该结果提示,虾青素可调控成纤维细胞H/R损伤后的炎症反应(见 图3 )。
2 . 2 . 1 造模效果评估 本实验所选用的18只小鼠经5次缺血-再灌注循环后,背部皮肤均可见明显的压力性损伤创面,大体观察可见创面凹陷、痂皮形成,创周红肿,提示造模成功。造模过程中未见小鼠死亡[见 图4 (a)]。
2 . 2 . 2 创面愈合率 观察各组小鼠创面愈合图像发现,各组小鼠背部创面均随时间缩小。低、高剂量组各时间点的创面愈合率均显著高于模型组,平均创面愈合速度均较模型组更快[见 图4 (b)]。高剂量组创面愈合率最高,治疗后第7天可见创面明显皱缩,痂皮松动,几乎脱落。
2 . 2 . 3 创面组织病理学改变 由创面HE、Masson染色结果可见,治疗后第7天,模型组创面组织上皮缺损程度最高,皮下组织坏死形成的空泡最为明显;低剂量组仍有痂皮附着,但坏死空泡较模型组显著减少;高剂量组痂皮几乎脱落,可见明显的上皮和皮肤附属器再生,上皮化程度最高。此外,低、高剂量组炎细胞浸润较模型组减少,新生肉芽组织含量均高于模型组。治疗后第7天,模型组和低剂量组创面部位胶原沉积量少于高剂量组,胶原纤维排列杂乱;高剂量组的胶原沉积量高于其余两组,且胶原纤维排列更为整齐[见 图5 (a)]。
免疫组化结果表明,各组均可见TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-10阳性的细胞。高剂量组创面组织内TGF-β、IL-10阳性细胞含量明显高于其余组,TNF-α、IL-6阳性细胞较其余组显著减少,提示高剂量虾青素可显著提高压力性损伤组织的抗炎能力,改善缺血-再灌注后炎症反应[见 图5 (b)]。
2 . 2 . 4 创面组织活性氧含量 DHE染色呈红色,反映组织内ROS的含量。本文发现,模型组可见明显的红色荧光,低剂量组的荧光强度较模型组有所减低,而高剂量组红色荧光几乎不可见。荧光强度定量分析结果表明,低剂量组的平均荧光强度较模型组有所减低,而高剂量组的荧光强度明显弱于其余两组( P <0.05),见 图6
压力性损伤的发病机制涉及到外部生物力学因素和内部病理生理学因素 。生物力学因素主要包括:① 垂直压力。局部组织在受压期间缺血缺氧,大量氧自由基蓄积,组织内氧化损伤与抗氧化防御失衡。压力解除后,血流重新灌注,过度的氧供引发组织内氧自由基爆发和炎症系统过度激活;② 摩擦力。皮肤与床单或衣物表面摩擦,角质层受损,被汗渍、尿液等体液浸渍后更易形成压疮;③ 剪切力。剪切力是两层组织表面发生相对移动时引起的力,可在压力与摩擦力的基础上加速血管闭塞,进一步引起微循环障碍 。若损伤部位得不到及时有效的干预,极易出现各种并发症,如肿胀、出血、组织溃烂等,严重的情况下可能并发感染,危及患者生命 [13-15] 。因此,研究压力性损伤的修复对提高患者的生存质量具有重要意义。
虾青素是一种天然的脂溶性类胡萝卜素,能够有效清除活性氧和氧自由基,具有强抗氧化特性,可能具有促进压力性损伤修复的潜在作用。研究表明,虾青素可通过调控多种分子和通路发挥抗氧化作用,如NF-κB家族、MAPK2、JAK/STAT-3和 PI3K/AKT 信号通路等。近年来,多项研究报道了虾青素在创伤性脑损伤、糖尿病肾病、慢性阻塞性肺疾病等疾病模型中通过激活Nrf2信号通路发挥抗氧化作用 [16-21] 。另有研究表明,虾青素可通过下调 Wnt/β-Catenin 信号、激活 MEK/ERK 信号,从而抑制炎症反应 。
自美国食品药品监督管理局(FDA)于1999年批准虾青素用于膳食补充剂以来,国内外生产了多种以虾青素为主要成分或配方成分的膳食营养补充剂,各类产品价格适中,可在临床上或患者日常生活保健中广泛应用,希望成为皮肤损伤、心血管疾病和神经退行性疾病等多种疾病的辅助治疗手段 [24-25] 。
研究发现,压力大小和模式与组织损伤程度密切相关 。本文所用磁铁产生的压强高达40 kPa,能够完全阻断皮肤微血管血流,形成缺血性损伤,除去磁铁后血液重新灌注缺血区,组织损伤进一步加重,与临床上压疮的发病机制和疾病特征一致 。实验结果表明,虾青素可促进小鼠背部压力性损伤创面愈合,减轻缺血-再灌注对局部皮肤造成的病理损伤,此保护作用可能与其抑制ROS和炎症因子TNF-α、IL-6的过度产生,促进抗炎因子TGF-β、IL-10的合成与分泌有关。
本研究仍存在局限性:① 虾青素能够抑制压力性损伤创面的氧化应激与炎症反应,但其具体机制尚不明确;② 慢性创面愈合机制是多方面的,虾青素是否存在其他方面的作用(如抗感染、促进上皮细胞迁移、调控细胞自噬等)尚不明晰。以上问题有待今后进行深入研究。
虾青素作为一种强抗氧化剂,能够减轻缺血-再灌注后氧化应激,调控过度激活的炎症系统,从而保护缺血-再灌注引起的组织损伤,促进压力性损伤创面修复。
作者贡献声明： 陈杨负责研究实施、数据分析和论文撰写;马新润、王永辉协助动物实验;高蓓数据整理保存;高艳虹、许贞蓉进行整体研究设计、指导及论文修改。
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高艳虹 2 
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