摘要 目的 研究正常活动和剧烈运动下胰岛素治疗对2型糖尿病大鼠股骨远端松质骨中固体受力和流体流动特性、骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)分化的影响。方法 基于Micro-CT扫描图像构建正常活动和剧烈运动下4周和8周胰岛素治疗实验的对照组、糖尿病组、治疗组和安慰剂组大鼠股骨远端松质骨和流体的有限元模型,并利用流固耦合数值模拟方法,分析各组模型的力学参数和细胞分化参数;并对力学参数、细胞分化参数与形态学参数进行相关性分析。结果 正常活动和剧烈运动下,胰岛素治疗改善了2型糖尿病大鼠的固体和流体力学参数、BMSCs分化参数。对于4周实验,正常活动与剧烈运动下胰岛素治疗分别使2型糖尿病大鼠的骨分化面积从64.024%增加至69.372%,以及从73.225%增加至75.336%;对于8周实验,正常活动与剧烈运动下胰岛素治疗分别使2型糖尿病大鼠的骨分化面积从67.239%增加至72.910%,以及从76.147%增加至78.291%。形态学参数中的BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、SMI与骨、软骨分化面积均具有显著相关性(P <0.05)。结论 剧烈运动下8周胰岛素治疗组松质骨表面的BMSCs更容易分化形成骨组织。研究结果对进一步理解正常活动和剧烈运动下胰岛素对骨的影响具有重要意义,并为临床上治疗2型糖尿病时胰岛素治疗周期和运动方式的选择提供理论指导。
关键词:
2型糖尿病
胰岛素
松质骨
流固耦合
流体剪应力
糖尿病分为1型和2型两种类型,其中2型糖尿病(T2DM)最常见,该类患者占糖尿病患者总人数的90%以上 [1] 。T2DM除了会导致血管受损,危及心、脑、肾、周围神经和眼睛外,还会使得骨形成减少及骨愈合延迟,从而导致骨折风险增大 [2] 。胰岛素治疗可以改善T2DM大鼠的骨微观结构和力学性能 [3] 。此外,外载荷是影响骨吸收和骨形成的重要因素之一,正常活动和剧烈运动时骨的外载荷不同,且正常活动和剧烈运动下胰岛素治疗对骨形成和骨吸收的影响还不清楚 [4-7] 。明确正常活动和剧烈运动下胰岛素治疗前后T2DM大鼠松质骨表面骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)分化形成骨组织的情况,对于评估正常活动和剧烈运动下胰岛素治疗是否有助于修复T2DM导致的骨退变非常重要。当骨受到外部载荷时,会产生应变、应力,在松质骨内部的液体流动会产生流速,从而在骨小梁表面产生流体剪应力(fluid shear stress, FSS),而应变和FSS共同作用可使BMSCs分化形成新骨 [7] 。因此,为了明确松质骨表面BMSCs分化形成骨组织的情况,首先需要清楚松质骨模型的固体和流体力学参数 [8] 。
受在体测量实验技术的限制,学者们通过流固耦合(fluid-solid interaction, FSI)数值模拟方法研究骨内液体流动的空间分布和动态变化。已有研究对建立的松质骨有限元模型进行FSI数值模拟分析,得到流体速度、FSS和压力梯度等参数的分布 [9-11] 。但目前关于胰岛素治疗前后T2DM大鼠的松质骨研究还鲜有报道,在正常活动和剧烈运动下其固体和流体力学参数还不明确,从而难以预测BMSCs细胞分化情况。明确各组模型的力学参数和细胞分化参数,对于深入理解正常活动和剧烈运动下胰岛素治疗对骨的影响具有重要意义,研究结果可以为T2DM的临床治疗提供指导。
本文基于Micro-CT扫描图像构建4周和8周治疗实验的对照组、糖尿病组、胰岛素治疗组和安慰剂组大鼠股骨远端松质骨和流体的有限元模型,并利用FSI数值模拟方法,分析各组模型von Mises应力、流速和FSS大小和分布、BMSCs细胞分化参数,以及固体和流体力学参数、BMSCs细胞分化参数与形态学参数之间的相关性。
骨样本来自课题组之前开展的胰岛素对T2DM大鼠骨量、骨微观结构和力学性能影响的研究 [3] ,已经获得北京航空航天大学生物与医学工程学院科学与伦理委员会批准(编号BM201900064)。4周和8周治疗实验均分为4组,分别是对照组( n =10)、糖尿病组(T2DM组, n =10)、治疗组(T2DM+胰岛素组, n =10)和安慰剂组(T2DM+安慰剂组, n =5)。每组样本中随机选取3个大鼠右侧股骨远端的松质骨样本,共计24个样本。
将大鼠右侧股骨区域扫描图像导入Mimics 16.0(Materialise公司,比利时)中进行三维重建。从股骨远端选取0.8 mm×0.8 mm×0.8 mm立方体区域的松质骨作为固体域[见 图1 (a)～(d)],松质骨周围0.86 mm×0.86 mm×0.86 mm的立方体作为松质骨所处的充满骨髓液的流体域[见 图1 (e)]。所有松质骨样本的选取位置保持一致。将上述所建的固体和流体三维模型导入Geomagic Studio 12(Geomagic公司,美国)中进行优化处理,在“多边形”模块下使用“砂纸”功能结合“删除钉状物”“松弛”“快速平滑处理”“减少噪声”等功能光滑表面,优化处理后的松质骨模型如 图1 (c)所示。将优化后的固体和流体模型在3-matic 12.0(Materialise公司,比利时)中以0.01 mm网格尺寸的二阶四面体单元进行网格划分,再利用ANSYS ICEM 14.0(ANSYS公司, 美国)实现流体和固体交界面上的节点一致,划分网格后的松质骨模型如 图1 (d)所示。所有固体和流体模型的单元总数的范围分别为96 278～205 805、126 597～276 728个。
FSI分析用于研究骨质中的von Mises应力和骨髓中的FSS分布。设定松质骨为均匀、各向同性的线弹性材料。4周治疗实验中,对照组、糖尿病组、治疗组和安慰剂组弹性模量分别为11.65、8.00、9.60、7.95 GPa;8周治疗实验中,对照组、糖尿病组、治疗组和安慰剂组弹性模量分别为15.10、10.55、13.75、10.5 GPa [3,12-13] 。泊松比为0.3 [14] ;设定骨髓为牛顿流体,密度为0.95 g/cm 3 、动力黏度系数为85.5 Pa·s [14] 。
固体底面固定,在顶面进行单轴压缩加载,正常活动和剧烈运动的总体压应变分别为0.1% [9] 、0.3% [15] ;流体模型壁面采用无滑移边界条件,正常活动和剧烈运动的入口处平均流速分别为0.1 [9] 、4.35 μm/s [15] ,出口处压力为0。
1.4 Micro-CT扫描检测大鼠股骨远端松质骨微观结构参数
使用NRecon(Skyscan 1076,Bruker公司,比利时)三维重建股骨远端松质骨的兴趣区域(region of interest,ROI)区域(与 图1 中的取骨位置和方法相同),而后使用CTAn(Skyscan 1076,Bruker公司,比利时)对所有组大鼠股骨远端松质骨样本的形态参数进行计算,包括骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、结构模型指数(structure model index,SMI)。
Prendergast等 [8] 提出的细胞分化定量理论提供了激励和组织分化之间的关系,可以通过应变和FSS来预测骨小梁表面的组织分化情况。固体表面的力学激励值包括固体模型的表面应变和流固交界面的FSS。
式中: ε 1 、 ε 2 、 ε 3 分别为第1、2、3主应变。
式中: η 为流体黏度;d v/ d x 为流速在流层法线方向的变化率。
式中: a =0.037 5%; b =10 mPa [16] 。
根据 S 可模拟预测BMSCs在不同激励水平下的分化结果:当 S <0.01时,激励值过小不能诱导分化;当0.01< S <1时,分化形成骨组织;当1< S <3时,分化形成软骨组织;当3< S <6时,分化形成纤维组织;当 S >6时,激励值过大不能诱导分化。
使用COMSOL Multiphysics 5.5(COMSOL公司,瑞典)对所有模型进行FSI稳态分析,得到松质骨的von Mises应力分布、松质骨内液体的流速分布和松质骨表面的FSS。为避免边界影响,选取松质骨中心0.7 mm×0.7 mm×0.7 mm子区域的数据进行分析。典型模型中的von Mises应力、流速和FSS均表示为平均值。使用Origin 2024(OriginLab公司, 美国)中的Correlation Plot插件(Spearman方法)对固体和流体力学参数与形态学参数,以及对细胞分化参数与形态学参数进行相关性分析。
2.1.1 股骨远端松质骨von Mises应力分布 无论是正常活动还是剧烈运动,4周实验的对照组、糖尿病组在松质骨侧面处von Mises应力均最大(见 图2 )。
图2 各组股骨远端松质骨von Mises应力分布
2.1.2 股骨远端松质骨内液体流速分布 无论是正常活动还是剧烈运动,对于8周实验,糖尿病组中松质骨在靠近股骨内侧液体具有更大的流速,治疗组和安慰剂组中松质骨在靠近股骨远端处的流速更大。域内液体均主要沿加载的方向流动(见 图3 )。
2.1.3 股骨远端松质骨FSS分布 剧烈运动下,4周实验的对照组、糖尿病组和安慰剂组,以及8周实验的对照组,松质骨在靠近股骨远端处的FSS均最大(见 图4 )。
2.1.4 各组固体和流体典型模型主要力学参数比较 无论是正常活动还是剧烈运动,在4周和8周实验中,von Mises应力、流速和FSS均值对照组均大于糖尿病组,治疗组均大于糖尿病组,安慰剂组和糖尿病组均比较接近;无论是正常活动还是剧烈运动,在对照组、糖尿病组、治疗组和安慰剂组中,8周实验von Mises应力、流速和FSS均值均分别大于4周实验;对于同一个模型,剧烈运动时的上述3个参数值均分别大于正常活动(见 表1 )。
表1 各组股骨远端松质骨典型模型von Mises应力、流速和流体剪应力均值
2.2 正常活动和剧烈运动下胰岛素治疗对细胞分化结果的影响
根据1.5节中 S 值计算方法,骨和软骨分化面积分别为流固交界面上0.01< S <1、1< S <3的节点数除以流固交界面上的总节点数。结果显示,无论是正常活动还是剧烈运动,在4周和8周实验中,对照组骨分化面积均大于糖尿病组,治疗组骨分化面积均大于糖尿病组,安慰剂组骨分化面积和糖尿病组均比较接近。对于4周实验,正常活动与剧烈运动下糖尿病组和治疗组的骨分化面积分别为64.024%和69.372%、73.225%和75.336%;对于8周实验,正常活动与剧烈运动下糖尿病组和治疗组的骨分化面积分别为67.239%和72.910%、76.147%和78.291%。无论是正常活动还是剧烈运动,在对照组、糖尿病组、治疗组和安慰剂组中,8周实验骨和软骨分化的总面积均分别大于4周实验;对于同一个模型,剧烈运动时骨和软骨分化的总面积大于正常活动(见 图5 )。
图5 正常活动和剧烈运动加载对各组骨和软骨分化面积的影响比较
通过计算得到各组典型模型BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和SMI(见 表2 )。
2.4 形态学参数与力学参数、细胞分化参数的相关性
对固体和流体力学参数与形态学参数,以及细胞分化参数与形态学参数进行相关性分析(Correlation Plot插件中的Spearman方法),系统地分析形态学参数与仿真计算得到的力学参数、细胞分化参数之间存在的内在联系。结果显示,流速与von Mises应力、FSS显著正相关( P <0.01);von Mises应力与FSS显著正相关( P <0.01)[见 图6 (a)]。形态学参数中的BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、SMI与骨、软骨分化面积均具有显著相关性( P <0.05),其中Tb.Sp和SMI与骨、软骨分化面积均显著负相关( P <0.05)。形态学参数中与软骨分化面积相关性最大的是BV/TV、Tb.Th和SMI( P <0.01);与骨分化面积相关性最大的是SMI( P <0.01)[见 图6 (b)]。
图6 形态学参数与力学参数、细胞分化参数的相关性分析
为了明确正常活动和剧烈运动下胰岛素治疗对T2DM大鼠骨的影响,本文通过Micro-CT扫描图像构建了4周和8周治疗实验的对照组、糖尿病组、治疗组和安慰剂组大鼠股骨远端松质骨和流体的有限元模型,并利用FSI数值模拟方法,分析正常活动和剧烈运动下胰岛素治疗对T2DM大鼠松质骨中固体和流体力学参数、BMSCs分化参数的影响。
本文结果显示,固体von Mises应力、骨内流体流速和FSS的结果与Zhao等 [9] 报道的结果类似,显示出相同的数量级。本文发现,von Mises应力与FSS显著正相关( P <0.01)。Hambli等 [17] 研究认为,固相von Mises应力与FSS呈正相关关系;Li等 [18] 对小鼠股骨的松质骨进行FSI数值模拟研究,发现在固液交界面上固体基质中的von Mises应力和流体场中的FSS呈正相关的关系。本文结果与上述结果一致。
本文结果表明,胰岛素治疗周期和运动方式会影响各组模型的细胞分化参数。与4周实验相比,8周实验可以更有效地促进骨组织和软骨组织的生成;与正常活动相比,剧烈运动可以更有效地促进骨组织的生成。细胞分化参数除了受外部载荷的影响外,还取决于形态学参数。有研究认为,不同的支架形态使得流体的流动路径不同,从而会产生不同的流速,并导致FSS不同,同时支架的力学性能也会不同,由此可以说明形态学参数的差异会导致流体激励的差异,进而影响BMSCs分化结果 [19] 。与上述究结果类似,本文结果表明,形态学参数与细胞分化参数具有显著相关性( P <0.05)。Zhang等 [20] 对牛骨和鼠骨内松质骨进行有限元分析,发现松质骨的形态学参数与细胞化参数均具有显著相关性,本文结果与该结果一致。
本研究的局限性如下:① 假设松质骨为均匀、各向同性的线弹性材料,忽略了骨髓的黏弹性;② 考虑到计算的时间和资源,很难对整个股骨模型进行计算,本文仅对4周和8周治疗实验的对照组、糖尿病组、治疗组和安慰剂组中所有股骨远端上各选取的一小块立方体区域的松质骨进行了FSI分析。在未来的动物实验研究中可以加入不同运动模式治疗组,以进一步理解正常活动和剧烈运动下胰岛素治疗对T2DM大鼠微观结构、宏观和纳观力学性能的影响。
本文构建了大鼠股骨固体域和流体域的有限元模型,利用FSI数值模拟方法分析正常活动和剧烈运动下4周和8周胰岛素治疗对T2DM大鼠松质骨中固体和流体力学参数、BMSCs分化参数的影响。结果表明,胰岛素治疗改善了T2DM大鼠的固体和流体力学性能、BMSCs分化结果。FSS、von Mises应力、流速、骨和软骨分化面积随胰岛素治疗周期和运动方式的变化而变化。其中,剧烈运动下8周胰岛素治疗组松质骨表面的BMSCs更容易分化形成骨组织。
作者贡献声明： 武晓丹负责研究实施与论文撰写;史佩佩、胡小容负责数据分析统计;宫赫负责研究设计与论文指导。
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