摘要
目的 分析梯度流体剪应力(fluid shear stress, FSS)流场中细胞膜张力分布。方法 构建梯度平板流动腔模型,采用流固耦合数值模拟方法,研究不同FSS梯度和幅值、不同静水压下细胞膜的膜张力分布。结果 当流动腔入口流量增大时,FSS流场梯度呈正比例增大。梯度FSS流场下,细胞膜张力由贴壁侧向顶部呈先减小后增大的趋势。在正常人体血压下,静水压越大,细胞膜张力越大。当FSS幅值一定时,增加FSS梯度,细胞高、低FSS区域平均膜张力差值增大;当FSS梯度一定时,增加FSS幅值,细胞高、低FSS区域平均膜张力差值增大。结论 梯度FSS流场会引起细胞膜张力的局部差异,其可能是破骨前体细胞在梯度流场中定向迁移的重要原因。
关键词:
梯度平板流动腔
梯度流体剪应力
破骨前体细胞
膜张力
外力大小或方向改变时,骨骼会通过骨重建改变其结构和形态,而骨重建通常包含破骨细胞主导的骨吸收和成骨细胞主导的骨形成两个过程 。当骨组织受到外部力学载荷作用,会引起骨基质变形,导致液体部分存在压力梯度,最终驱使液体流动 。液体流动会显著影响骨组织细胞的生物学响应,并调控骨重建过程。
人体长期重复的运动会使骨组织内部产生不同尺度的微裂纹 。载荷作用下骨间隙液流动产生的流体剪应力(fluid shear stress,FSS)以及骨微裂纹周围存在的具有梯度的FSS流场会使骨组织细胞发生一系列生物学响应,其中较大裂纹附近破骨前体细胞的定向迁移和分化是骨重建发生的重要前提 。本课题组前期构建了能形成梯度FSS流场的流动腔,发现破骨前体细胞在该流场中发生迁移的方向不是沿培养液的流动方向,而是会向低剪应力区迁移 [10-11] 。研究表明,细胞内Ca 2+ 浓度分布可能会影响破骨细胞的迁移 [12-15] ,而发生迁移的细胞内Ca 2+ 浓度升高,且呈“迁移前端低、尾端高”的浓度梯度。尾部高钙信号与尾部回缩直接相关,而迁移前端钙含量极高但半衰期很短的微区域被称为“钙闪烁”现象,能够调节细胞定向及转弯活动。
细胞膜上有许多离子通道。其中,力敏感性离子通道可以感受力学刺激,实现胞外力学信号向胞内转导,例如瞬时受体电位通道(transient receptor potential, TRP)、Piezo蛋白通道等。因此,细胞质内Ca 2+ 浓度升高与细胞膜上力敏感性离子通道有着密切的关系。本课题组前期数值模拟结果表明,在梯度FSS流场下,细胞表面FSS呈现极性分布 。因为力敏感性离子通道的门控与细胞膜张力密切相关,故推测这种FSS的极性分布可能会引起细胞膜张力的局部差异,进而不同程度地激活力敏感性Ca 2+ 通道,最终调控胞内Ca 2+ 浓度分布。为了证明上述猜想,本文通过有限元模拟方法,构建梯度平板流动腔模型,模拟梯度FSS流场,进而以破骨前体细胞为研究对象,探究其在不同梯度FSS流场及不同静水压下的膜张力分布。
使用COMSOL 6.0软件建立平板流动腔有限元仿真模型。基于本课题组前期实验所使用的梯度平板流动腔的几何构型 ,建立仿真模型。流动腔长度 L =50 mm,宽度 W =12 mm,横截面为梯形,由入口至出口方向左侧高 h 1 =0.8 mm,右侧高 h 2 =0.2 mm[见 图1 (a)]。根据FSS幅值和静水压条件,确定细胞位置,建立贴壁细胞模型,半径 r =10 μm。考虑细胞膜厚度很小,此处将皮质层与细胞膜合并,厚度 d =1 μm。对细胞 x 、 y 方向每10°进行分割操作,以方便后续数据采集[见 图1 (b)]。建立1个边长 a = b =0.2 mm、高 c =0.02 mm的长方体,使细胞位于长方体底面中心,以实现局部网格加密[见 图1 (c)]。平板流动腔内液体为水,压力 p =101.3 kPa,温度 T =37 ℃(人体体温)。细胞膜视为超弹性材料 ,密度 ρ =1 100 kg/m 3 ,选取广泛使用的Mooney-Rivlin超弹性双参数模型,用应变能函数表示为 :
W = C 10 ( I 1 -3)+ C 01 ( I 2 -3)
式中: W 为应变能函数; C 10 和 C 01 为材料参数(MPa)。一般存在如下关系 : C 10 / C 01 ≈0.1～0.2。而弹性模量 E [
{
"name": "text",
"data": "γ"
}
] =6( C 10 + C 01 )。本文取 C 10 =1.312 5 MPa, C 10 =187.5 kPa; I 1 、 I 2 分别为第一、第二应变不变量。
模型采用自由四面体网格进行划分。考虑到流动腔尺寸远大于细胞尺寸,对细胞周围长方体流体域网格加密。其余部分网格无需过密,以提高计算效率。经过网格无关性验证,取细胞膜最大单元1.0 μm,最小单元0.8 μm,最大单元增长率1.1。在细胞膜表面设置6层边界层网格。最终模型包含33 275 024个网格单元。
模型采用COMSOL 6.0软件中的GMRES算法进行稳态计算。平板流动腔入口设置为流量边界;出口设置为压力边界,出口边界处压力为 p out 。模拟中通过调整流量 q 实现平板流动腔不同FSS梯度的调节。流动腔其他边界设置为无滑移壁面,贴壁细胞膜贴壁处设置为固定约束。在无细胞状态下计算流动腔局部流体压力,将细胞外压力记为 p ex ,细胞内压力记为 p in ,然后根据理想薄膜理论 ,静态条件下膜应力 σ m0 可表示为:
细胞膜张力通常为0.03～10 mN/m [20-21] 。为使模拟结果尽可能接近真实值,假设破骨前体细胞静态下膜张力为0.5 mN/m。将 r 、 d 和 σ m0 代入式(2)可得 p in = p ex +100 Pa。
在模型中加入细胞,并赋值细胞内压力载荷 p in 进行计算。细胞膜外表面设为流固耦合交界面,耦合类型为全耦合。
本文应用等效线性化方法计算细胞膜张力,即根据板壳理论假设薄膜应力和弯曲应力均为平行于中面的正应力,分别沿厚度方向均匀分布和线性分布 [22-23] 。其中,薄膜应力 σ m 是与合力等效的应力,弯曲应力 σ b 是与合力矩等效的应力。因此,膜张力 F 的计算公式为:
式中: γ 为流体剪切速率; η 为绝对黏度, η =1 mPa·s [16,24] 。
正常成人血压为低压8～12 kPa,高压12～18 kPa 。本文设置8、10、12、14、16、18 kPa共6个血压值作为流动腔出口压力 p out 。细胞膜上力敏感性离子通道张开时间通常为几ns,而安静状态下正常成人心率为60～100次/min,故不考虑血压脉冲所致静水压变化的问题。本实验中应用的FSS梯度为0.05、0.1、0.2 Pa/mm,FSS幅值为0.1、0.4、0.8、1.5 Pa 。本文设置流动腔入口流量 q =300、600、1 200 mm 3 /s ,模拟不同的FSS梯度,并覆盖之前课题组工作的实验条件。
为明确能够得到准确计算结果的网格数量,首先进行网格无关性分析。本文设置最大单元 n 1 和最小单元 n 2 分别为1.0/0.8 μm、0.9/0.7 μm、0.8/0.6 μm、0.7/0.5 μm、0.6/0.4 μm、0.8/0.6 μm、0.4/0.2 μm,并对上述模型进行数值模拟。取流动腔出口压力 p out =18 kPa,流动腔入口流量为600 mm 3 /s,FSS幅值为0.1 Pa,沿液体流动方向计算细胞膜张力。结果表明,随着网格单元数的增加,模型计算的膜张力并没有较大变化,其变化范围均在0.06%以下(见 图2 )。因此,综合考虑模拟结果准确性和计算效率,选择细胞膜网格最大单元 n 1 =1.0 μm,最小单元 n 2 =0.8 μm。
为探究流动腔入口流量与FSS梯度的关系,设置流动腔出口压力 p out =18 kPa,入口流量 q =300、600、1 200 mm 3 /s 进行模拟,取坐标( x , y , z )为(0,10,0) mm、(12,10,0) mm两点所构成截线,计算流动腔底面沿此截线的FSS分布。结果表明,流动腔呈现梯度FSS,梯形截面高边侧FSS偏高[见 图3 (a)]。沿横截线方向,底面FSS先线性增大,但在 x =11 mm处开始快速减小。随着入口流量 q 增大,FSS梯度几乎呈正比例增大[见 图3 (b)]。经计算, q =300、600、1 200 mm 3 /s时,对应的FSS梯度分别为0.05、0.1、0.2 Pa/mm。
根据课题组前期实验结果 ,取FSS梯度为0.1 Pa/mm,FSS幅值为0.4 Pa,设置出口压力为18 kPa,探究梯度FSS下细胞膜张力分布规律。结果表明,细胞膜在FSS作用下发生形变,由贴壁侧向顶部形变逐渐增大,且呈低FSS侧比高FSS侧形变大、上游侧比下游侧形变大的现象[见 图4 (a)]。靠近底面处,细胞膜张力最大;距底面60°～70°,细胞膜张力最小。以底面为基准,由贴壁侧向顶部,细胞膜张力先减小后增大,且减小较快,增大较慢[见 图4 (b)]。对比细胞膜对称位置膜张力,FSS梯度方向( x 方向)上,除距底面60°、80°处,细胞膜高FSS侧膜张力较大,且距底面30°处膜张力差Δ F 最大;水流方向( y 方向)上,除距底面30°、50°处,上游侧张力较大,且距底面10°处膜张力差最大[见 图4 (c)]。对细胞表面FSS高、低半球细胞膜张力取平均值,高FSS侧膜张力较大,差值 为8.70 μN/m。
为探究FSS梯度与幅值对细胞膜张力的影响,设置流动腔出口压力 p out =0 Pa,FSS梯度为0.05、0.1、0.2 Pa/mm,FSS幅值为0.1、0.4、0.8、1.5 Pa。对细胞在底面的投影面平均分为四等份[见 图5 (a)],对比细胞表面高FSS(high fluid shear stress,HFSS)区域和低FSS(low fluid shear stress,LFSS)区域的平均膜张力,以及上游侧(upstream side, US)和下游侧(downstream side, DS)区域的平均膜张力。结果表明,FSS幅值一定时,随FSS梯度增大,HFSS、LFSS区域膜平均膜张力差值增大,US、DS区域平均膜张力差值增大。FSS梯度为0.05 Pa/mm时,随FSS幅值增大,HFSS、LFSS区域平均膜张力差值增大;FSS梯度为0.1、0.2 Pa/mm时,随FSS幅值增大,HFSS、LFSS区域平均膜张力差值减小。FSS梯度一定时,随FSS幅值增大,US、DS区域平均膜张力差值增大;且当FSS梯度为0.05、0.1 Pa/mm,FSS幅值低于0.8 Pa时,US、DS区域平均膜张力差值为负[见 图5 (b)]。
为探究静水压与细胞膜张力的关系,考虑人体正常血压值附近的变化,设置出口压力 p out =8、10、12、14、16、18 kPa进行数值模拟。结果表明,随着静水压增大,细胞平均膜张力呈线性增大[见 图6 (a)]。当静水压在血压范围内,随FSS梯度和FSS幅值增大,HFSS、LFSS区域平均膜张力差值增大,US、DS区域平均膜张力差值减小;且随静水压增大,HFSS、LFSS区域平均膜张力差值增大,US、DS区域平均膜张力差值增大[见 图6 (b)]。
本文建立了梯度平板流动腔的计算模型,构建了不同梯度的FSS流场,以探究梯度FSS对细胞膜张力分布的影响。计算结果表明,梯度FSS作用下,由贴壁侧向顶部,细胞膜张力先减小后增大,且减小较快,增大较慢。在高静水压下,细胞膜产生形变位移,呈被压缩趋势,故细胞膜张力的分布可能与细胞膜的形变位移有关。细胞顶部附近膜张力的分布规律与本课题组前期研究得到的梯度流场下细胞膜表面FSS分布规律相似 ,一定程度上证明了梯度流场下细胞膜张力受FSS的影响。FSS梯度方向细胞膜对称位置距底面30°处膜张力差Δ F 最大,表明距底面30°左右的位置可能是细胞膜感应FSS梯度的关键位置。
当流动腔出口压力为0且FSS幅值一定时,随着FSS梯度增大,HFSS、LFSS区域平均膜张力差值增大。FSS梯度为0.05 Pa/mm时,随FSS幅值增大,HFSS、LFSS区域平均膜张力差值增大;FSS梯度为0.05、0.1、0.2 Pa/mm时,随FSS幅值增大,HFSS、LFSS区域平均膜张力差值减小。上述结果证明,FSS梯度和FSS幅值增加能够引起细胞HFSS、LFSS区域张力差的增加,这可能会引起力敏感性Ca 2+ 通道激活程度增大,从而使Ca 2+ 内流增加,最终促使细胞向LFSS区迁移。本课题组前期实验发现,在30 min间隔下,当FSS幅值较小时,随FSS梯度增大,细胞向低剪应力区域迁移速度和角度呈增大趋势;当FSS幅值增大至0.8 Pa时,细胞向低剪应力区域迁移速度和角度随FSS梯度增加呈减小趋势 。该实验观察结果与本文数值模拟结果一致。离子通道激活的时间通常为ns级。因此,尽管本文发现细胞膜张力局部差异较小,引起的离子通道激活程度的差异可能较小,但其引起的离子通道激活程度的差异可能会在时间的积累下使胞内Ca 2+ 浓度呈现梯度,进而引发细胞的定向迁移。
本文模拟结果还发现,当FSS幅值一定时,随FSS梯度增大,US、DS区域平均膜张力差值增大。而当FSS梯度一定时,随FSS幅值增大,US、DS区域平均膜张力差值增大;且当FSS梯度为0.05、0.1 Pa/mm,FSS幅值低于0.8 Pa时,US、DS区域平均膜张力差值为负。基于上述结果,推测US、DS区域膜张力的差异可能会影响该区域Ca 2+ 内流,进而调节细胞向低剪应力区域的迁移角度。当US、DS区域平均膜张力差值为负时,DS区域Ca 2+ 内流可能比US区域多,使细胞抵抗水流的影响向低剪应力区域迁移。
本实验未考虑人体血压,实际上静水压也可能会对细胞膜张力产生影响。Piezo1是一种力敏感性Ca 2+ 通道,可通过膜张力进行门控。有研究证明,高静水压干预能够增加细胞中Piezo1介导的钙内流 。本文发现,静水压越大,细胞膜平均张力越大。该结果说明,高静水压可能是通过增大膜张力的方式,增加Piezo1介导的钙内流,进一步验证了本文所建立模型的有效性。当静水压控制在血压范围内,随FSS梯度和FSS幅值增大,HFSS、LFSS区域平均膜张力差值增大,US、DS区域平均膜张力差值减小;且随静水压增大,HFSS、LFSS区域平均膜张力差值及US、DS区域平均膜张力差值增大,说明静水压能够调节细胞膜张力,且静水压越大,细胞膜对梯度FSS的感应越明显。因此,血压的动态变化可能对细胞膜张力起到调节作用。
本研究的局限性如下:① 为保证胞内外的相对压强,方便流固耦合模拟,模型中并未添加细胞质和细胞核,仅对细胞膜进行研究。然而,细胞有细胞骨架、细胞核以及许多细胞器,且细胞核的刚度和黏度均为细胞质的数倍。在外力作用的初始阶段,细胞会表现出瞬时弹性,即存在小变及变形后的恢复过程 [21,28] 。② 为了探究不同静水压对细胞膜张力的影响,模型采用环境压强为固定值,未能模拟人体内血压脉冲的生理环境。因此,本文结果尚不能保证所得到的细胞膜张力与实际完全一致,但能反映FSS梯度对细胞膜张力的影响趋势。
本文应用流固耦合有限元模拟方法,建立梯度平板流动腔模型,计算得到不同FSS梯度、FSS幅值、静水压下的膜张力分布。计算结果表明,梯度FSS能够引起膜张力分布的局部差异。出口压力在人体血压范围内,当FSS幅值越大且FSS梯度越大时,这种现象越明显。梯度FSS引发的细胞膜张力分布可能是破骨前体细胞在梯度流场中定向迁移的重要原因。本文研究结果可为骨微裂纹附近破骨前体细胞定向迁移现象的机制提供基础数据,并为理解力致骨重建的细胞和分子机制提供重要依据。
作者贡献声明： 曹淑婷负责数值模拟、数据分析、论文撰写;赵森、张笑负责协助建立模型;高颜负责协助数据分析;霍波负责设计研究、协助数据分析和论文修改。
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