摘要 针对当前生命与医学研究面对的挑战,分析生命系统在分子、亚细胞、细胞和组织不同尺度的力化耦合行为,并试给出各尺度力化耦合的定量关系。这些定量关系说明生命系统在各个尺度的结构与它们的力稳态紧密相关,即结构的变化必将导致力稳态的改变;反之,力稳态变化也必将导致结构的变化。生命系统力稳态的产生源于分子尺度肌球蛋白作用而产生的细胞骨架的收缩张力,并借助生命系统的多级结构实现各级结构的力的自稳态。因此,力化耦合机制及其定量关系启示研究者可以发展一个从全新角度去认识和治疗疾病的思路和方法,即力医学。最后,讨论力医学认识和治疗疾病的可能路径,为新的医学范式提供诊疗思路和方法。
关键词:
力化耦合
自稳态
力稳态
力医学
当今时代,不仅心脑血管、癌症和神经退行性疾病等疑难杂症难以攻克,心理疾病、亚健康等问题也越来越多地困扰人们的身心健康和正常生活。因此,人体和疾病的研究和探索仍然任重道远。生命系统是一个多尺度和多层级的巨复杂系统,与非生命系统相比,生命系统的基本单位,细胞本身也是复杂系统。同时,生命系统具有其独特的力学性质或行为,例如力的自稳态、力化耦合、涌现现象。
自稳态(homeostasis)是生物学中的重要概念 [1] 。它指生物体内部环境和结构的一种稳定状态。在自稳态中,生物体可以将其结构和内部的各种生化过程维持在一定的水平,以保持生物系统的稳定性。在分子尺度,结构的自稳态即是分子构型的能量极值态,如蛋白质分子大多具有两种以上的稳定结构或状态 [2] ;在亚细胞尺度,黏着斑作为细胞与胞外基质的锚点,可以保持稳定的结构,如其结构尺寸大概为几个μm [3] ;而与黏着斑紧密相连的应力纤维则可维持其一定的长度和排列方向 [4] ,构成了细胞尺度结构自稳态的基础;在细胞尺度的自稳态,表现为一定的细胞黏附、铺展和极化状态;在组织尺度,则表现为组织内特定的细胞排列、极化方向和组织形态。
研究发现,生物系统不仅存在结构的稳态,还表现出力的稳态或称机械稳态 [5-6] ,如肌球蛋白的作用导致肌动纤维的收缩张力稳态 [7] ,及与此相应的黏着斑上的应力稳态;细胞尺度上的张力大小和分布稳态 [8-9] ,多细胞系统的张力(卵的发育)稳态 [2,10] ,组织内的张力稳态(动脉血管 [11] ),以及经筋系统的张力稳态 [12] (见 图1 )。
力化耦合不是简单地指力作用在分子、细胞或组织上而产生变形等响应行为,而是分子、细胞或组织的结构稳态与其对应的力稳态的耦合。生命系统可在多个尺度上保持结构和力稳态的耦合,这种多尺度多层级的耦合行为是生命现象的基本特征,也是生命和非生命系统的根本区别之一。虽然非生命系统也会在力的作用下发生变形或化学反应,但是不能维持结构的稳态和与力稳态之间的耦合关系。
在分子尺度,如蛋白质分子在外力作用下产生构型及功能的变化,构成了生命系统力化耦合的物质基础;外力可以调节其结构和状态转变的能量势垒,故蛋白质分子的构型/能量状态与其所处的力学环境紧密相关。在亚细胞尺度,黏着斑和应力纤维的力化耦合行为最为典型,而且它们相互依存。黏着斑的力化耦合体现为其面积与加在其上的张力成正比,而其上的剪应力维持1个稳态值,约为 5 kPa [3,13] ;而应力纤维的力化耦合是其长度与其张力正相关,而其张应变维持1个稳定值,为 0.1～0.2 [14-15] 。
分子和亚细胞尺度的力化耦合相对直接和直观,但是在细胞和组织尺度却较难于观察和理解,需要基于数学建模的定量研究。最近关于细胞牵引力的定量研究发现了牵引力-距离关系 [8] ;关于多细胞群落行为的研究发现了应力驱动的细胞极化和排列行为等 [16] ;以及在组织尺度上冯元祯先生提出的著名的应力与生长关系 [11] 。
分子尺度的力化耦合借助亚细胞结构形成了细胞内的化学信号网络,从而构建了亚细胞和细胞尺度上的力化耦合。细胞尺度的力化耦合借助于细胞连接构建了组织尺度的力化耦合。因此,生命系统中的力化耦合系统是多尺度多层级的复杂系统,是生命和非生命系统的重要区别,也是理解生命系统的一把钥匙。
基于对生命系统各个尺度的力化耦合性质和行为的分析,自然想到从力学角度来理解疾病和寻求治疗疾病的策略,即力医学。
力医学是一个新兴的领域,它是一个基于生物力学和力学生物学研究所获得的知识和技术进行诊断和治疗疾病的新的医学思路。它提出了利用力学概念、理论和方法,从生命力的角度对疾病进行诊断和治疗的策略和方法。
英文“Mechanomedicine”一词最早出现在Bloomfield [17] 于1955年发表的论文中。在该文中“Mechanomedicine”是指与“人文医学(humanistic medicine)”相对的基于化学药物的医学,现在该词意已鲜有人使用。“Mechanomedicine”作为力医学的概念和内涵最早是由Wang [18] 于2009年在iMechanica 网站的Journal Club中提炼和总结。他将力医学定义为基于力学生物学和生物力学的医学,与基于化学的医学形成鲜明的对比,指出力医学可提供新的诊断和治疗疾病的方法和技术。
目前,生物力学/力学生物学在疾病的机理研究和诊断技术发展方面有了长足的发展,在生物医学工程领域扮演着越来越重要的角色。但是,在疾病治疗的理论和技术方面的发展还比较有限,对于如何通过力学方法来调节生理和病理过程还缺乏定量的认识。根据病理学的定义,疾病即指偏离正常健康指标的状态 [19] ,它导致细胞和组织结构和性质的明显变化,即为病变。因此,疾病是生命在不同尺度上的结构与相应稳态的偏离,相应的也会导致其力稳态的偏离 [6] 。医学的任务是恢复/修复这些损伤,将细胞和组织调回正常状态。这些正常状态即为生理的稳态。最近的研究表明,力稳态的偏离与疾病紧密相关,包括发育异常、癌症和非完美的伤口修复 [20-21] 。目前,研究者对力稳态的了解还相对甚少。如果能够定量调节生命体内的力稳态,就创造了一种全新的治疗疾病的策略。
本文结合近年来在实验与理论研究方面所取得的成果,对生命系统不同尺度的力化耦合(力稳态和结构稳态的耦合)进行梳理和分析,进而提出力医学可能的工作范式。希望通过这一新的医学思路能够克服现代医学所面对的一些困境问题,例如应对病毒变异、选择药物靶点、设计药物递送等问题 [22] 。
分子尺度的力化耦合是直接和直观的。研究表明,蛋白质的功能与其三维空间结构密切相关,因而其结构的变化将导致其功能的变化 [2] 。外力可以改变或调节蛋白质的构型,以此来调节蛋白质的功能,以及蛋白质与其他蛋白或分子的作用 [23-24] 。分子尺度的力化耦合是生命系统更高尺度上的力化耦合的基础。以对细胞的力学行为和力敏感行为至关重要的黏附蛋白整合素(integrin)为例。整合素是一类表达于细胞表面的重要黏附分子,介导细胞-细胞、 细胞-胞外基质及细胞-病原体间黏附以及细胞内外双向信号转导,在凝血反应、 炎症反应、肿瘤转移和创伤愈合等许多病理生理过程中起关键作用 [25] 。
整合素具有3种构象： ① 弯曲的低亲和态(low affinity, LA); ② 直立且头部关闭的(head-closed)中间亲和态(intermediate affinity, IA); ③ 直立且头部打开的(head-open)高亲和态(high affinity, HA)[见 图2 (A)～(E)] [26] 。在低亲和态下,整合素的两个亚基均弯曲成倒 V 形,使头部结构域接近并指向细胞膜,这种结构不利于与配体结合,为 LA 构象;与配体结合过程中或外力作用下,整合素产生大幅度构象变化,其 α 和 β 亚基在胞内区的连接打开并在胞内区和跨膜区分离,杆状结构直立致使头部结构域弹出(switchblade-like),为 IA 构象;进一步,若β亚基Hybrid domain摆出(swing out),则为HA构象。
研究发现,踝蛋白(Talin)的头部与整合素的β亚基的结合可以激活整合素,促进其胞质区与肌动蛋白纤维的连接 [27-28] 。在肌动蛋白纤维的作用下,整合素将进一步调整其构象,形成高亲和激活态,导致整合素的簇集(clustering)以及应力纤维和黏着斑的形成和成熟,从而触发细胞内相关的信号传导路径,并最终调控细胞的生理功能 [29] 。
Sheetz等 [27] 研究了细胞在迁移过程中,整合素在细胞前缘被激活、聚集并形成黏着斑,然后在细胞后缘解离的过程。该研究表明,激活的整合素与前缘基质结合,并与肌动纤维骨架连接;在细胞骨架的作用力下,整合素聚集并与其他黏附分子一起形成成熟和稳定的黏着斑。在细胞后缘,踝蛋白与整合素解离以及信号分子 Shc与 β3-整合素结合(β3-integrin)导致了整合素从高亲和态到低亲和态的转变,致使与应力纤维和基底脱开。因此,细胞骨架张力的消失直接导致了细胞后缘黏着斑的解离。应力纤维的张力在整合素的激活,聚集和解离的整个循环过程中起着关键的调节作用。
在黏着斑中,除了整合素、踝蛋白(talin)外、还有许多其他黏附蛋白,如黏着斑蛋白(vinculin)、桩蛋白(paxillin)等超过上百种黏附蛋白,应力纤维的张力将激活或调节这些蛋白功能,以实现黏着斑和细胞的力敏感行为 [25] 。事实上,由整合素介导的牵引力可以在几十秒内导致黏着斑蛋白的募集 [30] ,而激活的黏着斑蛋白又进一步调节桩蛋白(paxillin)的募集 [31] 。这些蛋白的相互作用对于黏着斑和应力纤维的形成和稳定起到重要的作用。研究发现,talin-vinculin等关键力敏感蛋白可形成稳定的超分子结构。借助于高精度的力学操控技术,可以定量分析talin-vinculin超分子的力学稳定性,并揭示细胞黏附连接的力学响应与调控的分子机制 [32] 。另外,细胞微丝骨架的最主要连接蛋白α-辅肌动蛋白(α-actinin)对细胞骨架的完整性、细胞黏附的稳定性有着关键作用。研究发现,在张力作用下,α-actinin的结构域去折叠,暴露出与vinculin的高亲和度结合位点,进而与vinculin结合,从而激活vinculin依赖的信号通路 [33] 。
分子尺度的力化耦合借助亚细胞结构形成了细胞内的化学信号网络,进而构成了亚细胞和细胞尺度上的力化耦合。信号网路是力化耦合的表现和承载形式,力会改变或触发信号网络。下面以与黏着斑的力敏感行为相关的通路为例说明。
黏着斑中多种多样的力敏感黏附蛋白是构成细胞黏附依赖的力敏感通路网络的分子基础。整合素、踝蛋白及黏着斑蛋白在力刺激作用下其分子构型将发生变化,这些变化可以通过应力纤维激活胞内的力敏感蛋白; 反过来,胞内力敏感蛋白能够通过黏着斑对细胞力学微环境产生主动响应 [34] ,例如黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK) [35] 。
FAK 的磷酸化过程是细胞感知基质力学性质的重要生物学过程之一。它对细胞的增殖、迁移、极化及分化等行为均有重要的影响 [36] 。研究表明,FAK 通过其末端蛋白结构域与踝蛋白相连,而踝蛋白又与整合素相连,进而被整合素分子招募进细胞黏附结构中;然后,在力刺激下FAK发生构型变化,进而产生磷酸化过程 [37] 。在细胞质中,FAK 与 Src-家族激酶分子(Src-family kinases, Src)形成信号复合体发挥重要的生物学功能。FAK磷酸化使得Src 与 FAK 结合并促进 Src 的激活,在细胞内形成短暂的 FAK-Src 信号复合物,激活下游的信号通路,在细胞很多行为(如细胞运动和细胞增殖等)中发挥重要的作用 [38] 。例如,FAK-Src 信号复合体下游的一个重要的信号通路是 Ras 同族体基因家族成员A(RhoA)介导的信号通路,该信号通路可以调控细胞骨架的形成、重构及解离等动力学过程 [39] 。FAK-Src 信号复合体能激活下游信号分子 Rho,从而进一步激活下游哺乳动物 Dia 相关蛋白 1(mDia1)和 Rho 相关蛋白激酶(ROCK) [40] 。其中,mDia1 可以促进肌动蛋白丝的聚合;而 ROCK 可以激活 II 型肌球蛋白(myosin II),提高其与肌动蛋白丝的结合能力,两者共同组合形成细胞内的应力纤维,增强细胞内的牵张力。
以上描述主要是基质力学特性依赖的整合素及其下游信号通路的情况。细胞内存在上百万种生物化学信号分子,多种信号通路相互交织行使其特定的功能。近年来的研究表明,化学信号诱导的信号通路与力学因素诱导的信号通路有共同的下游调控分子。因此,细胞内化学信号和力学信号是耦合的,共同影响着细胞的生物学行为。
例如,在与细胞核相关的信号通路中,上皮细胞中信号转导蛋白 3(Smad3)信号通路与 TAZ 信号通路均能抑制心肌素相关转录因子(myocardin-related transcription factor, MRTF)进入细胞核,进而抑制 MRTF 激活下游靶基因,降低 α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达。因此,Smad3信号与TAZ信号常常表现为协同作用。此外,当细胞受到力学刺激时(如基底拉伸、基底硬度升高),细胞内收缩力提高,从而促进 TAZ 进入到细胞核中 [41] 。
在免疫应答过程中,免疫受体与配体互作激活跨膜信号转导并调控免疫细胞的黏附、迁移和抗原识别等重要功能。体内微环境的力学刺激(包括血流剪切力、细胞牵拉力、膜张力及支持力等)时刻影响着免疫受体配体互作和跨膜信号转导。免疫受体的力学-化学耦合调控机制一直是分子力学生物学、免疫学和蛋白质科学的研究热点。Chen 等 [42-44] 应用单分子力谱技术,揭示了选择素和整合素的力学-化学耦合调控的分子机制,阐明了生物力对选择素、整合素介导的免疫细胞黏附和迁移的调控规律。
蛋白质分子和 DNA/RNA在力作用下的构型变化(或者分子键的解离)可以用粒子克服能量势垒的模型来描述。最经典的模型即是Bell 模型 [45] ,它描述了在外力作用下能量势垒降低,使得分子构型发生变化或分子键解离,实现分子尺度下力与化学/结构的耦合：
τ = τ 0 exp[( E 0 - γf ) /k B T ]
式中： τ 0 为时间常数; E 0 为能量势垒; γf 为外力 f 所做的功; k B T 为热扰动能量。Bell模型适用于外力比较大的情况,即滑移键[见图 2(F)]。
也有很多情况下,当力比较小的时候,分子结构/或者分子键反而会得到加强,即为逆锁键[见图 2(G)]。逆锁键是受体和配体蛋白质相互作用过程中的一种“反常”现象,其键寿命在特定范围内会随着所施加外力的增加而增加。参与细胞黏附、细胞活化等过程的很多力敏感蛋白都具有逆锁键的行为,并与滑移键组成分子开关来调节各项与分子黏附相关的生命活动。龙勉等 [46] 研究发现,P-选择素与PSGL-1配体键的寿命随外力先增加(逆锁键)再减小。多种物理因素可调控外力介导的受体配体键解离。P选择素与PSGL-1配体键的断裂强度随分子接触时间先经历一个上升的过渡阶段,然后达到一个饱和平台值;或者随分子接近速度增加而呈现出一个转折阈值。而P选择素与PSGL-1配体键黏附概率随分子分离速度增加而表现出两相性特征 [47] 。
在亚细胞尺度,黏着斑和应力纤维是一对孪生兄弟,共同构建了细胞内的张力稳态,对于细胞的力敏感行为、力学和化学信号的传递、细胞的各种生理过程起到至关重要的作用。他们的动态行为充分体现了力学和化学的耦合。
黏着斑不仅是细胞与基底间的物理连接,而且是细胞与基底之间力学信号的传导通路,在细胞的力敏感行为方面扮演着重要的角色。细胞黏着斑感知细胞外力学微环境,并通过细胞骨架如应力纤维传递信号,激活细胞质内相关生物化学信号通路,从而影响细胞的生物学行为。细胞黏着斑的形成通常包括3个阶段：整合素成簇(形核)、初生黏附形成及黏附斑成熟 [27] 。黏着斑的这种演化行为是典型的力化耦合行为,与黏附分子如整合素(integrin)、踝蛋白(talin)、黏附斑蛋白(vinculin)、黏着斑激酶(FAK)及桩蛋白(paxillin)等的力化耦合行为密切相关。这些黏附分子的力化耦合行为是黏着斑的力敏感行为的分子基础。
实验显示,机械力可以调节黏着斑的生长和稳定性。在应力纤维牵张力的作用下,黏着斑会不断生长并成熟 [48] 。如果抑制GTPase Rho的活性,减弱或阻断应力纤维的牵张力,黏着斑就会分解 [49] 。同时,实验发现作用在黏着斑上的力较小时,例如通过微流控装置施加的流体剪切力 [46] 和微吸管划擦施加的牵张力 [49] ,会促进黏着斑的生长;但是当作用力较大时,又会导致黏着斑的解离 [50-52] 。相关实验证据发现,很多种细胞,如成纤维细胞和内皮细胞在周期性载荷作用下发生转向重排,与加载方向成60°或垂直排列,即细胞黏着斑解离,细胞在新的方向形成新的黏着斑。
黏着斑的这种力化耦合行为与黏附分子的力化耦合行为紧密相关,特别是整合素的力化耦合行为。例如,整合素的两个活性结构态,中亲和态和高亲和态,介导了力作用下整合素的聚集和整合素与配体的结合。基于整合素的这种力化耦合行为,Kong等 [54] 发展了基于分子机理的细胞黏着斑模型(见 图3 )。模型考虑了整合素的聚合以及整合素与基底配体结合的动力学过程,以及应力纤维和基底力学性质的影响。模型预测发现黏着斑对力学载荷的响应存在着两个临界值[见 图3 (D)]。当载荷幅值小于第1个临界值时,整合素尚未被激活,黏着斑不生长。当载荷幅值大于第1个临界值但小于第2个临界值时,整合素处于高亲和态,促进了整合素的聚集,黏着斑开始生长。当载荷幅值大于第2个临界值时,整合素与基底配体的分子键解离,进而导致了黏着斑的解离。基于分子机理的黏着斑模型成功地解释了外力既可以导致黏附斑生长又可以使其解离的实验现象。
以上结果说明,较小的牵引力促进了黏附分子向黏着斑的聚集,但是如果牵引力过大,黏着斑中的分子键将被破坏,从而导致黏着斑的解离 [54-56] 。牵引力调节的黏着斑的稳定性对于黏附细胞的力敏感性和迁移起着至关重要的作用。
Aroush等 [48] 观测了单个黏着斑随时间演化的行为,发现主要分为3个阶段：生长阶段,稳定阶段和破坏阶段。在生长阶段,黏着斑面积随时间呈线性增长,此时黏着斑尾部几乎保持静止,而前端不断长大;在稳定阶段,黏着斑面积不再增长,达到饱和状态,此时犹如“踏车现象”：在黏着斑尾部发生整合素-配体的解聚,而在黏着斑的前端发生整合素-配体的聚合,维持该阶段的力约为几个nN;在破坏阶段,整合素-配体的解聚行为主导了黏着斑的行为。Kong等的黏附斑模型预测重现了上面的实验观察结果 [54] 。
如上所述,应力纤维产生的收缩力调节黏着斑的组装和动力学。激光纳米切割实验和药物处理实验也证明了这一点,该实验表明,应力纤维的张力可以快速调节斑联蛋白(zyxin)定位到黏着斑的过程 [57-58] 。
实验显示,黏着斑上所承受的力与其面积成正比关系 [59] 。黏着斑单位面积上的作用力,大约为5.5 nN/μm 2 (5.5 kPa) [3,13] ,可以看作黏着斑的生理常数。对于不同类型细胞,此常数在1～10 kPa范围 [59] ,故被称之为力稳态。
实验发现,细胞黏着斑的力敏感行为和力化耦合行为与细胞的力学环境有关,比如黏着斑的生长和成熟与细胞外基质的力学性质相关。在比较硬基底上,它的面积大,可承受较大的牵张力;在软基底上,面积小,只能承受比较小的牵张力。当基底刚度小于1个临界值时(约50 kPa),黏着斑面积随着基底刚度的增加而增大;当基底刚度大于临界值,黏着斑的面积将不再增加 [60] 。
应力纤维与黏着斑是一对孪生兄弟。黏着斑的生长和稳定需要应力纤维的张力激活和维持,而应力纤维结构的锚点是黏着斑。应力纤维在细胞的黏附、迁移、分化和组织形成等众多生理过程中起着重要的作用。
应力纤维主要由肌动蛋白丝通过α-肌动蛋白绑定而成,是细胞骨架的重要构成部分 [61] 。腹部应力纤维(ventral)的两端通常连接在黏着斑上,而横向弧状纤维(transverse arc)通常通过背部应力纤维(dorsal)与黏着斑相连[见 图4 (A)]。在腹部应力纤维和横向弧纤维通常存在周期性分布的肌动蛋白和肌球蛋白,但是在背部应力纤维中通常缺乏肌球蛋白,因此腹部应力纤维和横向弧纤维可以产生主动收缩力,而背部应力纤维只起连接作用 [61] 。腹部应力纤维的长度可达几十μm,直径约为300 nm,断裂力为约 400 nN,预拉伸的张力约为几个nN [14] 。应力纤维的基本单位是肌小节[见 图4 (B)],肌小节的肌球蛋白的摆动使得肌动纤维丝产生收缩,使得应力纤维产生了预张力。
应力纤维的本征性质(包括预张力、弹性/黏弹性性质等)对细胞的力敏感性起着关键作用。应力纤维中肌动蛋白和肌球蛋白间相互作用是其主动收缩并产生预张力的原因,实验已观察到应力纤维预张力的存在。例如,通过激光切断单根应力纤维,可以看到应力纤维在断口处瞬间的回缩 [15] 。应力纤维被激光割断后回缩的现象证明了应力纤维有预应力和预应变的事实[见 图4 (C)] [62] 。应力纤维内的预应变在 0.1～0.2 的范围。
应力纤维的预张力通过黏着斑传至胞外基质,并引起基质变形,从而可以感知基质刚度。虽然应力纤维的预应变有一定的范围,但其张力可以有比较大的变化范围,与相连的黏着斑的面积紧密相关。因为黏着斑的大小与基底刚度呈正相关关系,因而应力纤维的张力即与基底的刚度正相关。实验还证明,应力纤维的长度与基底的刚度也正相关。应力纤维在比较硬的基底上会变长、变粗、极化 [4] ,而在软基底上,应力纤维比较细,比较短。相对应地,黏着斑在硬基底上面积大,而在软基底上面积小。该现象会在细胞尺度的力化耦合现象再讨论。
应力纤维的解离和聚合与其承受的张力大小密切相关。Costa等 [63] 设计了一个精巧的实验来定量测量贴壁内皮细胞中应力纤维的预拉伸/张力。该研究在预拉伸的膜上培养细胞长达28 h(在2%血清中),之后逐渐释放膜中的拉伸变形,并测量应力纤维开始弯曲的临界拉伸变形。通过计算,得到纤维预拉伸在15%～26% 之间。观察发现,因为屈曲后预张力消失,应力纤维会在1 min内解离。有更多的实验证明,应力纤维的稳定性依赖于肌球蛋白-II产生张力,如果抑制肌球蛋白II将导致应力纤维的解离 [58,64] 。在细胞中,黏着斑是应力纤维的锚点。当黏着斑稳定时,应力纤维的张力可以得以维持,促进应力纤维的聚合或者维持应力纤维的稳定。当黏着斑破坏时,应力纤维的张力将减小或消失,其本身也将解聚。因此,应力纤维与黏着斑是相互耦合的亚细胞结构。
大量的实验表明,在周期性基底牵拉作用下,细胞会发生转向并会与加载方向呈一定的角度或垂直方向排列[见 图4 (D)] [50-52] 。细胞发生重排的机制是当加载幅值或频率高于一个门槛值时,应力纤维会发生解离并在新的方向聚合。细胞的转向行为与载荷幅值、加载频率等有关[见 图4 (E)]。研究证明,在周期加载下细胞的转向与应力纤维和黏着斑的力敏感性密切相关 [55-56,65] 。研究表明,外力可以调节应力纤维和黏着斑的稳定性、解离和聚合。细胞在循环载荷作用下的旋转行为,实际上反映了外力作用下对黏着斑/应力纤维的力化耦合行为的调节作用,以及黏着斑/应力纤维的力稳态行为。Safran等 [66] 提出了唯象的理论,将细胞简化为力偶极子。模型预测循环载荷干扰了应力纤维/黏着斑中的力稳态。细胞/应力纤维的方向改变是为了使其张力重新回到稳态。
实验发现,细胞的铺展面积和形状与细胞外环境有关系,例如基底刚度影响细胞铺展,在软基底上的细胞通常是圆形,铺展面积较小;但在硬基底上的细胞通常铺展面积较大,而且会形成发射状的伪足。胞外基质的维度也影响细胞的铺展,例如在三维基质中细胞多为梭状,二维多为扁平状;胞外基质的表面微结构也会影响细胞的铺展,例如在各向异性的基底上细胞通常更喜欢沿着基底刚度较硬的方向铺展和迁移 [67] 。
细胞黏附在基底上,通过自收缩来探测其周围的力学环境。这种自收缩使得细胞与基底间产生了相互作用力,称为细胞牵引力。细胞的黏附、迁移、分化和组织形态等行为与牵引力的大小和分布有密切关系。因此,细胞牵引力引起了格外的关注。Rape等 [68] 研究了细胞形状和铺展面积对细胞牵引力的影响,观察到细胞牵引力以及黏着斑的面积都随着细胞铺展面积的增加而增加。Gardel等 [69] 和Dembo等 [70] 观察到在迁移的成纤维细胞和角膜细胞中细胞牵引力随着离开细胞边缘距离的增加而减小。在对培养在三维基底中细胞的研究中也观察到了相似的细胞牵引力与细胞铺展形状的关系 [71] 。这种牵引力分布对细胞的黏附、迁移等行为有重要的意义,值得深入研究 [72] 。
为了定量研究牵引力的分布和调控机制,He 等 [8] 提出了细胞-基底作用模型。该模型将细胞模拟为具有预应变的弹性圆盘,圆盘通过用弹性黏附分子连接在弹性基底上。模型考虑了细胞的主动收缩以及细胞-基底界面上黏附分子的分布(见 图5 )。该模型定量预测了细胞和基底间的牵引力的分布。预测结果显示牵引力的大小随着距离细胞形心距离的增大而增大,并将这个分布规律称为细胞牵引力-距离关系,即 T = f ( D )。对于较软基底,例如当细胞的刚度与基质的刚度相当或更软时,牵引力正比于到细胞中心的距离,则
式中： T 为细胞牵引力; D 为到细胞形心距离。
牵引力-距离关系揭示了细胞可以通过其铺展形状调控细胞牵引力分布,细胞内张力以及迁移速率的机理。它对于细胞调节细胞内张力环境以及与张力相关的细胞行为有重要的意义。例如,它可以揭示细胞迁移过程中驱动力产生的机制。迁移过程中的细胞形状通常是极化的 [73] 。迁移的成纤维细胞形状类似扇形,前端伪足部分较大,后部有一个较长的尾巴。这种细胞形态使得细胞前端面积远远大于尾部,细胞形心也就更靠近细胞前端。根据牵引力-距离关系,在后端尾巴处的细胞牵引力要比前部伪足部分大。呈新月形的角膜细胞也有一个较大的前部和像两翼一样的尾部 [74] ,因而其细胞形心同样是靠近细胞的前部,因而同样会导致其尾部两翼的牵引力大于其前部的牵引力。根据实验观察,两种迁移细胞的牵引力分布符合牵引力-距离关系 [70,74-76] 。实验证明,牵引力的这种分布规律与黏着斑的大小分布一致。根据黏着斑的力化耦合规律,即黏着斑的稳定性与力的关系,在细胞前端,相对较小的牵引力促进了黏着斑的形成和生长,同时在细胞尾部较大的牵引力导致了黏着斑的解离 [54] ,以及细胞尾部和基底之间的脱粘。这样就导致了细胞前后受力失衡,为细胞迁移提供了驱动力 [77] 。
除了细胞迁移行为,牵引力-距离关系对于细胞其他行为也有重要意义。有研究通过理论和实验发现,细胞内的力信号的传播距离与细胞内的预张力的平方根成正比 [78] 。根据牵引力-距离关系,对于铺展面积比较大的细胞或极化程度高的细胞,胞内的应力就大,故力的传播距离就比较远。因此,信号的传递就更通畅,细胞各方面的活性就更高。研究发现,在比较硬的基底上,细胞内糖的代谢较快,而在软基底上,糖的代谢较慢。研究表明,在硬基底上,应力纤维比较长,相应的胞内的张力大;而在软基底上,应力纤维比较短,相应的张力小 [4] 。
牵引力-距离关系给细胞极化注入了更丰富和深刻的意义。目前对于细胞极化的定义是指细胞结构意义上的不对称。维基百科定义细胞极化是指在细胞形状、结构以及细胞成分的分布和组织方面的不对称,它关系到细胞骨架成分、细胞器、细胞质各组分以及细胞内外信号的分布。根据牵引力-距离关系,由于细胞的极化,即细胞铺展面积和细胞骨架分布的极化,沿着细胞极化方向的牵引力会变大,而垂直于极化方向的牵引力就会相对较小。相应的,细胞骨架,如应力纤维沿细胞极化方向极化,其承载的张力也相应变大;而在垂直于细胞极化方向的应力纤维较短,其所承受的张力也相对较小。根据牵引力-距离关系,细胞极化的长细比可表示为：
式中： l major 和 l minor 分别为细胞长轴和短轴的长度; T major 和T minor 分别为长轴和短轴方向最大牵引力。如果 α ≫1,细胞可以简化为力偶极子,这是很多情况下细胞被简化为力偶极子的物理机制。
同时,实验观察到由于细胞的极化,在细胞骨架张力的作用下,细胞核也产生了极化,虽然细胞核的极化比细胞本身的极化程度相对要小。细胞骨架的张力作用在细胞核上自然会导致核内染色体的变形,进而影响基因的表达。同时,细胞和细胞核的极化也会影响细胞核对外界力学刺激的响应。Wei等 [79] 通过微磁珠对细胞施加不同模式的加载,定量研究了细胞刚度、染色质变形和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的表达行为。研究发现,沿着细胞长轴(0°方向,即应力纤维的排列方向)或其他方向(45°或90°)加载会导致染色质不同程度的变形,以及相应的不同程度的基因表达。其中原因即是极化的细胞中细胞骨架的定向排列导致了细胞刚度的各向异性。实验证明,破坏应力纤维可以消除不同模式作用下细胞硬度、染色质拉伸和DHFR基因上调的差异。同时,抑制肌球蛋白Ⅱ的活性将会降低细胞硬度、染色质变形和基因上调。基于考虑应力纤维排列的离散理论模型,可以预测实验的结果,并且揭示了加载模式依赖的细胞核响应行为的力学机制。这种加载模式依赖的细胞核响应行为的实质就是细胞尺度的力化耦合行为。
多细胞行为对于生理和病理过程中组织形态的形成和发展有重要意义,如上皮组织的形成、组织的修复和癌症的入侵和扩散等 [80-83] 。通常认为这些过程主要是由化学因子的空间梯度调节,例如组织形态生成过程中的形态发生素 [84-86] 。然而,力学信号在多细胞的极化、排列行为中也扮演着关键的角色。研究显示,基底的几何约束、几何形状调控了多细胞的行为,基底黏附的几何形状可以调控干细胞分化的趋势和位置 [87-89] ：细胞增殖发生在环形基底的外边界,细胞铺展面积较大;而细胞分化发生在内边界的区域,细胞铺展面积较小而极化程度高。
在多细胞生物的形态发育过程中,上皮细胞呈现出的多种多样的分布形式及形态变化 [90-94] ,比如在线虫腹部外壳形成过程及果蝇背部闭合过程中的细胞伸长现象 [91,93] ,以及变形虫发育过程中的细胞扁平化现象 [91,95] ,引起了人们的广泛兴趣。同时,研究发现细胞的排列对于伤口的形成/愈合模式和速度也有重要的影响 [96-97] 。
研究发现,细胞的极化和排列行为可能与细胞单层面内的应力分布有关 [98] 。作为由蛋白质构成的生物聚合物,细胞骨架在剪切作用下会产生流变而发生转向行为,并趋向平行于主应力方向。因此,最大剪应力将决定细胞的这种转向行为,导致细胞沿着主应力方向排列,这与许多已有的实验观察一致 [99-100] 。同时,最大剪应力的大小又决定了两个方向的主应力差的大小,即细胞在两个主方向上拉应力的各向异性。可以推断,拉应力大的方向将会有利于维持应力纤维的聚合和细胞的铺展;相反,拉应力小的方向将会导致应力纤维的解聚和细胞的收缩。因此,可以通过细胞层面内最大剪应力的大小预测细胞的长细比,并且最大剪应力越大(即两个主应力方向的拉应力差越大),细胞长细比越大。因此,细胞层面内的最大剪应力是多细胞极化和排列的驱动力 [98] 。
基于液晶理论,He 等 [16] 提出了考虑细胞主动收缩应力的细胞模型(见 图6 )。通过这一模型,将细胞的主动收缩应力、细胞排列、和细胞极化显式地表示为细胞极化张量的函数。细胞的主动收缩应力的表达式为：
式中： Q [
{
"name": "text",
"data": "ij"
}
] 为极化张量,用于描述细胞的极化, Q [
{
"name": "text",
"data": "ij"
}
] =0表示细胞未极化,而 Q [
{
"name": "text",
"data": "ij"
}
] ≠0表示细胞极化。式(4)是对组织内细胞极化的定量描述,即为多细胞和组织尺度力化耦合的定量描述。如果把 记为主方向的形式,则为
为了确定细胞的极化张量,需要两组控制方程。一组为系统的平衡方程,另一组可通过对系统的自由能(包含细胞极化能和排列能)变分得到。通过求解这两组耦合的控制方程,可以计算组织的应力与应变场,并预测细胞的长细比和排列方向,同时可以分析基底刚度、细胞层的几何形状、外力和细胞活性对细胞极化和排列的影响。对于环形的细胞层,还给出了细胞极化和排列的轴对称问题的解析解,并且可以给出控制细胞长细比的参数组,这些参数组包含细胞和基底的刚度、细胞活性的强度以及外力等力学参量。模型预测发现,细胞沿细胞层中的最大主应力方向极化和排列,并且细胞长细比随平面内最大剪切应力的升高而增大,这表明最大剪应力是细胞极化和取向的驱动力。基于液晶理论的细胞模型对细胞长细比和排列方向的预测与实验观测符合。这些结果表明,细胞极化和排列模式由组织主动收缩产生的应力的各向异性程度决定。这种应力驱动的细胞极化和排列机制,使得细胞能够感知其空间位置,从而展示出依赖方向和位置的行为。这一现象揭示了组织形态调控的生物力学机制,及其在组织工程中潜在的应用价值。同时,这种应力驱动的细胞极化和取向行为的理论为理解细胞行为提供了一个新的视角。
实验发现,在果蝇卵发育过程中,卵表面的滤泡上皮细胞在S8～S10阶段发生剧烈的形态及排列变化[见 图7 (A)]：卵室前端的滤泡细胞扁平化,而后端的细胞圆柱化 [91,101-103] 。这种特别的细胞形态变化引发了发育生物学研究的广泛关注。
李晓梦等 [104] 利用基于生长模型的有限元方法模拟了果蝇卵S8～S10期的生长发育过程,计算了由于卵母细胞的生长而在卵组织和滤泡细胞层产生的生长应力[见 图7 (B)、(C)]。有限元分析显示,卵室前端鳞形细胞层面内最大主应力沿环向分布,面内最小主应力沿径向分布;而卵室后端柱形细胞面内最大主应力沿径向分布,面内最小主应力沿环向分布。结合实验观察分析[见 图7 (D)],随着果蝇卵室的发育,卵室前端鳞形上皮细胞沿环向扁平化,而后端柱形细胞沿径向圆柱化,由此形成了鳞形细胞长轴方向与卵室环向相切,而柱形细胞长轴方向与卵室径向平行的特殊排列方式。比较实验和计算结果可知,果蝇卵室发育过程中滤泡上皮细胞的极化方向与面内最大主应力方向保持一致。而果蝇卵室上皮细胞的长细比变化与其面内最大剪应力大小相关,即面内最大剪应力越大,则细胞长细比越大;反之,面内最大剪应力越小,则细胞长细比越小。以上结果与应力驱动的细胞极化和排列理论预测一致,验证了理论的正确性。
在此基础上,进一步利用变异双头果蝇卵研究了果蝇卵室生长量对滤泡细胞的影响。变异双头果蝇卵的种系细胞与柱形细胞的生长量均为正常果蝇卵的50%。模拟预测的果蝇卵室上皮细胞的变形规律与实验变形规律一致,即鳞形细胞沿环向方向扁平化为鳞形,柱形细胞沿径向伸长为柱形;相比之下,变异双头果蝇卵室的鳞形细胞扁平化程度降低,即长细比减小。因此,变异双头果蝇卵的种系细胞生长量的改变减小了鳞形细胞的长细比。其原因为种系细胞生长量的减半,使上皮细胞组织内的应力减小,则上皮细胞环向扁平化程度减小。与此同时,对于柱形细胞来说,柱形细胞生长量减半使其径向圆柱化程度减小,扁平化与圆柱化效果相抵,故柱形细胞长细比几乎不变。
眼角膜损伤引起的失明影响着越来越多人的身心健康和生活质量,人工角膜需求日益增大。然而,快速上皮化和稳定的上皮过程是角膜材料的两大挑战 [105-107] 。Xu等 [108] 通过3D打印技术制备了一种类似于天然角膜的具有曲率的角膜植入物。结果发现,角膜的曲率对于角膜的上皮化过程至关重要(见 图8 )。例如,在曲率比较高的角膜表面上皮细胞排列得更有序,上皮细胞的极化和排列方向沿着角膜的圆周方向;而且细胞与基底有更强的黏附,从而利于角膜的上皮化并促进神经再生。
图8 曲率调控的眼角膜上皮细胞排列、极化和黏附行为
为了理解角膜曲率对上皮细胞排列、极化和黏附的影响,采用基于 COMSOL 软件的有限元模拟计算角膜上皮细胞的面内应力 [108] 。模拟结果表明,细胞层的最大主应力沿圆周方向,与实验观察到的上皮细胞的极化方向沿着圆周方向一致。同时,模拟预测的面内最大剪应力与细胞的极化程度一致：由于曲率的影响,角膜穹顶区域的面内最大剪切应力小;而穹顶外到角膜边界的区域的面内最大剪应力大。对比实验观察结果,在角膜穹顶区域,细胞的长细比相对较小;而在角膜穹顶区域外,细胞长细比较大。因此,这些结果与应力驱动的细胞极化和排列理论预测一致,即细胞沿着组织的最大主应力方向极化和排列,组织内的面内最大剪应力是细胞极化和排列的驱动力。同时,模拟预测的细胞牵引力大小与实验测量的黏着斑大小分布一致。
综上所述,基于细胞和组织尺度上的力化耦合规律,利用角膜的曲率可以调控上皮细胞层的应力,从而调控细胞的极化和排列,进而促进了上皮组织的修复和再生。因此,通过优化角膜植入物的曲率可实现优化的上皮化、细胞黏附和神经元再生,从而治愈角膜缺损,为角膜植入物等生物材料设计开辟新的途径。
伤口愈合(wound healing)或间隙闭合(gap closure)是一种重要和基础的群体细胞行为,在许多生理和病理过程中扮演着重要角色 [109-111] ,包括胚胎发育中组织和器官形成 [112-114] ,伤口愈合中的组织修复 [115-116] ,以及在细胞凋亡过程中组织完整性维护 [117] 。研究表明,这些复杂的过程与单层细胞的细胞力学密切相关 [118-120] 。
为了研究外力对伤口闭合的影响作用,Xu 等 [96] 在 PDMS 基底上制备了含有椭圆形伤口的细胞单层,系统地研究了在周期性基底牵拉下的伤口闭合过程。实验发现,拉伸幅度和方向对伤口的愈合速度和愈合方式有显著影响。例如,拉伸幅值对伤口闭合速度的影响表现出双相性。在相对较小和较大幅度下,伤口闭合速度更快;而在中等幅度下,伤口闭合速度较慢。同时,拉伸还可以调节愈合模式。研究发现拉伸会增加垂直于拉伸方向的伤口愈合速度。具体而言,当拉伸沿伤口的长轴方向时,它会加速沿短轴方向的愈合速度,从而伤口愈合模式发生从玫瑰花瓣状到缝合线状的转变。相反,沿伤口的短轴方向拉伸则会加速沿长轴方向的愈合,导致愈合模式从缝合线状到玫瑰花瓣状的转变。
理论分析表明,伤口闭合过程是由细胞骨架的张力、细胞伪足的铺展力和伤口边缘肌动纤维环的收缩力等多种组织力共同作用完成。基底牵拉可以进一步调节这些因素的作用。例如,拉伸会改变细胞层中的应力场,同时调节细胞伪足伸出的方向。Xu 等 [96] 基于考虑细胞和组织主动应力的有限元方法,计算了在基底牵拉作用下椭圆形伤口的应力和应变场。模拟显示,拉伸对伤口处细胞层的应力和位移场有显著影响。与无拉伸的愈合过程相比,当沿长轴拉伸时,细胞层的面内最大剪应力在伤口短轴两端的应力集中增加了。此外,拉伸引起了伤口短轴处位移的增加。在无拉伸的情况下,短轴末端的位移小于长轴末端的位移。当在拉伸振幅10%的作用下,两个末端之间的差异变小;而当拉伸振幅增加到20%时,短轴端的位移超过了长轴端的位移。沿着长轴进行的拉伸促进了沿着短轴方向的愈合。造成了伤口愈合模式从玫瑰花瓣状到缝合线状的转变。当沿着短轴方向拉伸,与无拉伸的愈合过程相比,面内最大剪应力在长轴两端的集中程度有所增加。并且长轴末端处的位移较短轴末端处的位移增加;随着拉伸应变的增加,两端之间的差异随之增大,沿短轴方向的拉伸促进了伤口沿长轴方向的愈合。因此,拉伸作用会增加伤口边缘处的最大剪应力和位移,尤其是在垂直于拉伸方向的长轴端部,导致愈合模式从缝合线状到玫瑰花瓣状的转变。
以上结果显示,基底拉伸促进了细胞沿垂直于拉伸方向的铺展和迁移,使垂直于拉伸方向的愈合速度增加。另一方面,拉伸会减缓细胞在拉伸方向的迁移。这些结果再次体现了应力驱动的细胞极化和排列机制。同时,基底牵拉作用下伤口愈合的细胞机制将为通过机械力调节细胞集群行为提供了一种可能的有效途径。
基于生物力学和力学生物学的力医学是生物力学的前沿领域,也是力学学科与生命和医学的前沿交叉方向,是一个充满挑战和机遇的新兴领域。它与传统生命和医学领域的重要区别在于它从力学角度,而不仅是从结构的角度去认识生理和病理的过程。它试图通过借助生命系统在各个尺度的力化耦合,以及各尺度力化耦合之间的内在关系,为研究者打开一个认识生命和疾病的新窗口,以及干预和调节生命系统的新渠道。
本文从不同尺度(分子、亚细胞、细胞和多细胞组织)讨论了生命系统的力化耦合机制,并诠释了其本质为生命系统各级结构的稳态与其所对应的力稳态的耦合。这种耦合体现了生命系统运行的两条主线,一条主线是从化学和结构角度,是传统生命和医学的主要关注的路径,即通过观察和研究生命系统在各个不同尺度结构的变化,从而找到调控和修复病理损伤的方法。另外一条主线即是力医学的主线,即从力的角度认识和研究生命系统,并基于生命系统力稳态的观点,来认识和干预疾病。
结构的稳态是力稳态的结构基础。力的稳态是结构稳态的表现,即生命系统在各个尺度上所表现的力敏感行为。生命系统复杂的多级结构为分子尺度的力化耦合和力敏感行为传递到组织尺度提供了空间尺度上的桥梁。如在力学刺激作用下,蛋白分子构象和互作的变化引起了亚细胞结构的变化,最终影响了细胞尺度和组织尺度上的力学行为。同时,高级结构也为低级结构提供了力化耦合的平台和环境。如亚细胞尺度细胞骨架为蛋白间的相互作用及生物信号的传播提供了路径和媒介,又通过细胞与胞外基质间的黏着斑以及细胞间黏附,把信号传播到多细胞系统或组织。
值得注意的是,虽然不同尺度下力化耦合的表现形式不同,但都表现出了结构和力的耦合。在分子尺度,体现了分子构型与其能量(自由能)的耦合,或者其构型的寿命与外力的耦合;在亚细胞尺度,体现了黏着斑和应力纤维的结构稳定性与其所受张力的耦合;在细胞尺度,体现了细胞牵引力与距离关系律,或者细胞极化程度与其张力分布的耦合;在多细胞和组织尺度,则体现了细胞的极化和排列与其所处的组织内应力的耦合。同时,这种在高级尺度上出现的新的不同于低级尺度的力化耦合行为的新的力化耦合则体现了复杂系统所呈现的涌现行为。
从生命系统的多尺度力化耦合和力敏感行为中可以看出,分子键的解离和结合与力学信号间的耦合是力学信号转换为化学信号的机制和基础。基于力化信号的转化机制以及亚细胞尺度的结构和空间分布,并结合力学平衡原理可求解得到力信号在细胞尺度的空间分布,从而可以获得细胞的力敏感的行为,例如黏着斑在力学刺激作用下的生长和解离,应力纤维在周期性加载下的转向和重构,细胞牵引力和张力的重新分布,以及细胞的极化和迁移行为等。然后,基于细胞尺度的力化耦合机制,借助细胞间连接和细胞-基质间连接和组织空间结构,可以获得组织尺度的力敏感行为。
基于以上对生命系统力化耦合的讨论,本文提出了力医学的两种可能的工作范式(见 图9 )：
图9 力医学的两种工作范式：1)从底向上的范式,通过设计分子药物或机器,基于生命系统的多尺度力化耦合机制对细胞和组织损伤进行修复;2)从顶向下的范式,通过物理方法,在宏观尺度对病人的局部组织施加物理刺激(力、声、电、磁),基于生命系统的多尺度力化耦合机制对组织和细胞进行修复
(1) 从底向上的范式,通过设计分子药物或分子机器,调节细胞骨架张力,从而调节细胞内张力,进而调节细胞与胞外基质的黏附,及细胞间黏附,由此可以修复细胞的损伤;进一步,通过调节细胞骨架的张力,从而调节组织内的应力,进而调节细胞的排列和极化,由此修复组织的损伤。这种范式与现代药学的原理不同,现代药物的靶点是对异常表达蛋白进行抑制,从而消除或减轻症状。但是由于蛋白功能的复杂性,在很多情况下,对一种蛋白的抑制会影响与此蛋白相关的其他信号通路的正常工作,导致复杂的副作用。
(2) 从顶向下的范式,通过物理方法在宏观尺度对病人的局部组织施加物理刺激(力、声、电、磁),从而产生组织变形和组织应力,进而调整组织内细胞的极化和排列,由此对组织进行修复。进一步,由于调节了细胞的极化和排列,进而调节细胞内应力的大小和分布,从而调整细胞内的力稳态,以及与细胞内力稳态相关的信号传导和细胞代谢等过程,由此对细胞进行修复等。这种从顶向下的范式,与传统物理疗法的区别在于在多尺度力化耦合理论的指导下,治疗可以更定量和准确。
综上所述,基于多尺度力化耦合理论的力医学将提供定量的理论和工具,使研究者可以从不同的空间尺度,认识人类健康和疾病的发生和发展过程。这些定量的模型和理论不仅可以预测分子、细胞和组织行为,深化对生理和病理的认识,还可以定量指导对病理过程的干预,为人类健康的维持、疾病的治疗开辟新的视角。
(3)
(4)
(5)
微信
QQ空间
微博
QQ
