摘要
目的 探讨miR-199a-3p在流体剪切力(fluid shear stress, FSS)诱导成骨细胞增殖中的作用及其可能的分子机制。方法 对成骨细胞MC3T3-E1加载1.2 Pa FSS,时间分别为0、15、30、45、60、75、90 min。使用miR-199a-3p模拟物或miR-199a-3p 抑制物转染MC3T3-E1细胞。使用将过表达的miR-199a-3p以及其阴性对照分别转染MC3T3-E1细胞,并以1.2 Pa FSS处理45 min。将pcDNA NC、pcDNA-CABLES-1、si RNA NC、si RNA CABLES-1转染至MC3T3-E1细胞中。分别共转染pc DNA-CABLES-1与miR-199a-3p mimic以及si RNA-CABLES-1与miR-199a-3p inhibitor。CCK-8实验检测细胞活性;RT-qPCR检测CABLES-1、 miR-199a-3p、CDK 6、Cyclin D1、PCNA表达水平;荧光素酶报告实验检测CABLES-1和miR-199a-3p的靶向关系。免疫荧光检测CABLES-1蛋白表达。Western blot 检测CABLES-1、CDK 6、PCNA、Cyclin D1的蛋白表达。结果 FSS作用下MC3T3-E1细胞中的miR-199a-3p出现显著下调。过表达的miR-199a-3p抑制成骨细胞增殖,下调 miR-199a-3p表达促进成骨细胞增殖。miR-199a-3p可以逆转FSS诱导的成骨细胞增殖。双荧光素酶实验表明,miR-199a-3p靶向作用于CABLES-1,过表达的miR-199a-3p可抑制CBALES-1蛋白表达。CABLES-1能够促进成骨细胞增殖。miR-199a-3p通过CABLES-1抑制FSS诱导的成骨细胞增殖。结论 FSS诱导的成骨细胞增殖通过下调miR-199a-3p并通过靶向作用于CABLES-1实现。研究结果为FSS诱导成骨细胞增殖机制的研究提供新方向,也为未来机械刺激在骨关节疾病治疗中的临床应用研究提供新思路。
关键词:
流体剪切力
成骨细胞
细胞增殖
miR-199a-3p
成骨细胞是骨组织中重要的骨形成细胞,可以分化成熟为功能性的骨细胞,并与破骨细胞一起维持骨稳态的平衡 。而力学刺激已经被证明在维持骨稳态的平衡中起着重要作用 。适当的机械负荷促进骨形成,缺乏力学负荷则会引起骨量的丢失 。早在19世纪,Wolff就提出骨组织结构受到应力的影响,即骨折后骨组织会沿应力方向生长 。随着时代的进步,尽管Wolff的一些理论被认为存在不足,但是骨组织生长受到力学刺激影响的理论还是被广泛接受 。生理性的力学刺激可以促进骨组织的生长,而缺乏适当的力学刺激往往会抑制骨组织的生长。例如,在微重力环境下出现的骨质疏松症 。骨组织中主要存在压应力和流体切应力(fluid shear stress, FSS)两种类型的力学刺激,均由骨组织的微小形变产生 。研究表明,FSS对细胞具有更大的影响 。因此,本文主要探讨FSS对成骨细胞的作用。
MicroRNA (miRNAs)是一类低分子量、非编码的单链RNA,通过参与转录后修饰调控细胞生理过程 。研究已经证明,有部分miRNAs能够对力学刺激做出反应 。这些现象不仅出现在体外实验 ,同时也出现在体内实验 [13-14] 。FSS可以刺激成骨细胞的增殖 。然而,miRNA在FSS介导成骨细胞增殖过程中的作用仍然有待探索。
miR-199家族在多种肿瘤细胞的增殖过程中发挥着重要作用。同时有研究证明,在增殖的肿瘤细胞中,miR-199a-3p的表达量出现下降 [16-17] 。因此,本文推测低表达的miR-199a-3p可能会促进细胞的增殖。Yuan等 研究发现,在力学刺激下,骨组织中成骨细胞出现miR-199a-3p的表达下调。结合以上的研究,本文探讨miR-199a-3p对FSS介导成骨细胞增殖的作用,即FSS通过降低miR-199a-3p表达促进MC3T3-E1细胞的增殖。然而,本文结果表明,miR-199a-3p靶向作用于CABLES-1,FSS诱导的成骨细胞增殖通过下调miR-199a-3p并作用CABLES-1实现。
ME3T3-E1成骨细胞(中国医学科学院);α-MEM 培养基、优级胎牛血清、0.25%胰酶+EDTA 溶液(Gibico公司,美国);CCK-8试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)、双荧光素酶检测试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司);放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation Assay, RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);Trizol试剂、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒(Takara公司,日本);转染试剂(广州锐博生物技术有限公司);多聚甲醇、Triton X-100(上海碧云天生物技术有限公司);PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen)、CDK 6(cyclin-dependent kinase 6)、Cyclin D1一抗(Affinity公司,美国)、CABLES-1一抗(Affinity公司,美国),β-actin(Affinity公司,美国),二抗(Affinity公司,美国)。
1 . 2 . 1 细胞培养 将MC3T3-E1细胞接种到无菌培养瓶中,完整培养基含有10%胎牛血清、抗生素(青霉素G、链霉素)和α-MEM培养基。细胞置于37 ℃、5%CO 2 培养箱中,2～3 d更换1次培养基。
1 . 2 . 2 加载FSS实验 采用平行平板流动室装置(实用新型专利号: ZL201520637211. 6)模拟体外FSS 。本课题组先前研究证实,1.2 Pa是促进成骨细胞增殖的适宜FSS强度 。为了找到最佳FSS作用的时间,细胞在1.2 Pa FSS加载下分别接受0、15、30、45、60、75、90 min处理。此外,为了能够在加载FSS后继续实验,FSS加载装置经过高温消毒,并全程在超净台中完成实验。
1 . 2 . 3 细胞转染 按照说明配制转染试剂后,当培养瓶中细胞密度达到60%～80%时,将培养瓶中的培养基吸取并弃去。加入PBS清洗2～3次后,加入转染复合物1 mL于培养瓶中,再加入4 mL α-MEM。将烧瓶放入37 ℃、5%CO 2 培养箱中培养48 h。
1 . 2 . 4 qRT - PCR分析 使用Trizol法提取实验处理过的细胞总RNA。ND-1000分光光度计用于测定总RNA的浓度和纯度。逆转录合成cDNA,以cDNAs作为模板,采用qRT-PCR分别检测 miR-199a-3p、PCNA、CDK 6、Cyclin D1、CABLES-1的基因表达水平。qRT-PCR中所有数据均通过2 -ΔΔCt 算法计算。所用引物序列如 表1 所示。
1 . 2 . 5 双荧光素酶实验 构建CABLES-1的野生型(wild type,WT)和突变型(mutant type,MUT)3′UTR序列,并将其插入到荧光素酶载体。使用转染试剂分别将293T细胞与这些载体和miR-199a-3p模拟物或其阴性对照共转染。转染24 h后,应用荧光素酶测定试剂盒进行荧光素酶测定。
1 . 2 . 6 CCK-8实验 将实验处理后的成骨细胞制成细胞悬液。细胞计数后,将细胞悬液加入96孔板中。每孔中包含约1 000个细胞。预培养2 h后,继续培养至适当时间(24、48、72 h)。每孔加入10 μL CCK-8试剂,孵育1～4 h。然后用ELx800UV阅读器检查OD值。
1 . 2 . 7 蛋白质免疫印迹实验 (Western blotting)在经过实验处理后的细胞中加入RIPA裂解液后置于冰上缓慢摇晃 30 min 后,用细胞刮刀收集裂解液于1. 5 mL 的 EP 管中。然后,在 4 ℃、12 000 r/min 条件下离心 15 min,用移液枪缓慢吸取上清液于 EP 管中,加入上清液1/3体积量的蛋白上样缓冲液后煮沸3 min。以β-actin 作为内参; 配制聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE凝胶)。然后经过上样、电泳、电转、封闭、孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、曝光等步骤得到条带。
1 . 2 . 8 免疫荧光实验 使用多聚甲醇固定细胞15 min后使用0.5% Triton X-100通透细胞20 min。通透后用PBS洗涤3次,每次5 min。使用山羊血清对细胞进行封闭30 min。吸干山羊血清后,加入CABLES-1一抗孵育后在4 ℃过夜。然后用PBS洗涤细胞,在室温下加入相应二抗孵育2 h。最后,在室温下将DAPI滴入细胞10 min后使用荧光显微镜拍摄图像。
所有实验数据均重复3次。实验数据以均数±标准差表示,采用 SPSS 20.0 软件进行统计学分析,用 Image pro-Plus 6.0 软件测量条带灰度值,两组数据间统计学差异比较采用单因素方差分析, P <0.05表示差异有统计学意义。
2.1 FSS对成骨细胞增殖以及miR-199a-3p的影响
为研究FSS对细胞增殖的影响,将MC3T3-E1细胞置于FSS处理0、15、30、45、60、75、90 min。CCK-8检测显示,FSS处理45 min后,MC3T3-E1细胞增殖活力增强最明显。qRT-PCR分析显示,miR-199a-3p在该条件的FSS下相对表达量出现下调(见 图1 )。
图1 FSS对细胞增殖与miR-199a-3p表达的影响
为研究miR-199a-3p对成骨细胞增殖的作用,分别应用miR-199a-3p 模拟物(miR-199a-3p mimic)和miR-199a-3p 抑制物(miR-199a-3p inhibitor)在MC3T3-E1细胞中过表达和下调miR-199a-3p。qRT-PCR结果显示,miR-199a-3p 模拟物转染48 h后,miR-199a-3p水平明显升高,而miR-199a-3p 抑制物转染48 h后,miR-199a-3p表达显著降低。从CCK-8结果分析可知,过表达的miR-199a-3p抑制成骨细胞增殖,低表达的miR-199a-3p促进成骨细胞增殖。此外,通过检测增殖相关蛋白PCNA、CDK6和Cyclin D1表达水平,进一步研究miR-199a-3p对成骨细胞增殖的影响。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,转染miR-199a-3p 模拟物后miR-199a-3p出现过表达,PCNA、CDK6、Cyclin D1 mRNA相对表达量明显降低。转染miR-199a-3p 抑制物后miR-199a-3p表达量下调,PCNA、CDK6和Cyclin D1 mRNA的相对表达水平显著升高。同样,PCNA、CDK6和Cyclin D1蛋白表达水平也出现相同的差异(见 图2 )。本文认为,miR-199a-3p可以抑制成骨细胞的增殖。
2.3 过表达miR-199a-3p逆转FSS介导的成骨细胞增殖作用
FSS可以促进成骨细胞的增殖 [20-21] 。为研究miR-199a-3p在 FSS诱导的细胞增殖中的作用,在细胞接受FSS处理前已将miR-199a-3p模拟物及模拟物阴性对照转染进细胞内。CCK-8分析结果显示,与对照相比,FSS增强了细胞增殖能力;而过表达miR-199a-3p部分逆转了FSS诱导的细胞增殖能力。此外,增殖相关蛋白Cyclin D1、PCNA、CDK 6的mRNA和蛋白表达也出现了相同的趋势(见 图3 )。
图3 过表达miR-199a-3p逆转流体剪切力介导的细胞增殖
2.4 miR-199a-3p靶向作用于CABLES-1
为了检测miR-199a-3p是否靶向作用于CABLES-1,构建CBALES-1 3′UTR野生型序列(WT)和CABLES-1 3′UTR突变序列(MUT)。荧光素酶实验中,CABLES-1 3′UTR WT、miR-199a-3p、CABLES-1 3′UTR MUT的序列分别为5-GAGCA-GCACUUACUUACUACUGG-3、3-AUUGGUUACACG-UCUGAUGACA-5、5-GAGCAGCACUUACUUUGAUG-ACG-3。
荧光素酶活性结果提示,miR-199a-3p 模拟物抑制了CABLES-1 WT荧光素酶活性,但对CABLES-1 MUT无影响。结果表明,CABLES1是miR-199a-3p的直接靶点。此外,根据qRT-PCR和Western Blotting分析,miR-199a-3p主要影响CABLES-1的蛋白水平。免疫荧光检测也显示了同样的趋势,miR-199a-3p mimic降低CABLES-1的蛋白表达水平,而miR-199a-3p inhibitor增加了CABLES-1的蛋白表达水平(见 图4 )。
图4 miR-199a-3p靶向作用于CABLES-1
为探究CABLES-1对成骨细胞增殖的影响,用过表达载体(pcDNA 3.1-CABLES-1)过表达CABLES-1,用siRNA-CABLES-1抑制MC3T3-E1细胞中CABLES-1的表达。CCK-8实验表明,过表达CABLES-1可增加MC3T3-E1细胞的增殖能力,而下调CABLES-1可抑制细胞的增殖能力。过表达CABLES-1增加了PCNA、CDK6和Cyclin D1的mRNA表达水平,而下调CABLES-1后,这些基因的mRNA表达受到抑制。Western Blot检测CDK6、PCNA和Cyclin D1蛋白表达水平,出现了相同的趋势(见 图5 )。
2.6 miR-199a-3p通过CABLES-1调节成骨细胞增殖
为证明miR-199a-3p是否通过CABLES-1抑制成骨细胞增殖,将miR-199a-3p 模拟物与pcDNA-3.1 CABLES-1或 pcDNA3.1-NC共转染。在CCK-8试验中,miR-199a-3p 模拟物抑制成骨细胞的作用被过表达的CABLES-1所逆转。过表达CABLES-1也逆转了miR-199a-3p 模拟物诱导的PCNA、CDK6和Cyclin D1 mRNA表达水平和蛋白表达水平的下调。此外,使用si RNA-CABLES-1敲减CABLES-1基因可以逆转miR-199a-3p抑制物介导的细胞增殖活力增加。此外,敲减CABLES-1基因可抑制miR-199a-3p抑制物诱导的CDK6、PCNA和Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平增加(见 图6 )。
图6 miR-199a-3p通过CABLES-1调节成骨细胞增殖
已有研究表明,miRNA可以响应力学负荷,并且可能在成骨细胞分化和增殖中发挥重要作用 [12,22-23] 。这些研究发现,miR-199a-3p可以对力学刺激做出反应。然而,miR-199a-3p是否影响FSS介导的成骨细胞增殖及其可能的分子机制,仍然有待研究。本文结果提示,miR-199a-3p调控FSS介导的成骨细胞增殖,其中FSS通过下调miR-199a-3p促进成骨细胞增殖。进一步的研究发现,miR-199a-3p通过靶向作用于CABLES-1抑制成骨细胞增殖。综上所述,miR-199a-3p可通过靶向作用于CABLES-1调控FSS介导的成骨细胞增殖。
力学刺激已被证明是参与骨骼代谢的重要因素。压应力和FSS是骨中两种常见的力学刺激。在研究FSS和力学应变对骨细胞影响的体外实验中,尽管细胞通常对这两种刺激都有反应,但细胞对FSS的反应更大 。因此,与压应力相比,FSS在成骨细胞功能和骨代谢方面发挥更重要的作用。研究表明,FSS诱导的细胞增殖和分化与许多重要分子和信号通路有关。例如:FSS 可以快速增加细胞钙离子内流 以及三磷酸肌醇(IP 3 )、前列腺素E 2 、一氧化氮(NO) 在成骨细胞内的含量。此外,成骨细胞内的骨桥蛋白(OPN)的表达量同样受到FSS的调节, 类似的分子包括COX、PGI 2 。
从现有研究来看,力学敏感的miRNAs显示了其在FSS诱导成骨细胞分化和增殖中的重要性。Mai等 研究表明,在MC3T3-E1细胞中,有不止一种类型的miRNAs对FSS有反应。例如:miR-33-5p通过Hmga2 参与了FSS调节成骨细胞分化的过程 。
虽然许多研究探讨了miRNA在FSS介导的成骨细胞增殖和分化中的作用机制,但miR-199a-3p在FSS介导的成骨细胞增殖中的作用机制尚不清楚。本文结果表明,FSS下调MC3T3-E1细胞中miR-199a-3p的表达水平。MiR-199a-3p被认为在多在肿瘤细胞增殖的过程中发挥重要作用,其中包括前列腺癌 、结直肠癌 、卵巢癌 以及肺腺癌 。然而,miR-199a-3p在成骨细胞分化和增殖中的作用机制尚不清楚。有研究表明,miR-199a-3p在骨肉瘤细胞中表现为低表达 。结合以上的研究,本文认为miR-199a-3p的低表达可能会促进细胞的增殖。本文结果证明了低表达的miR-199a-3p可以促进成骨细胞的增殖,而过表达的miR-199a-3p抑制了成骨细胞的增殖。在此基础上,过表达的miR-199a-3p部分逆转了FSS介导的成骨细胞增殖。MicroRNAs通过调控其靶基因实现其功能。例如:miR-199a-3p通过FGF7调节了内皮细胞以及视网膜周细胞的增殖 。Liu等 研究提示,miR-199a-3p通过靶向作用于CABLES-1发挥作用。本文通过双荧光素酶实验得到相同的结果,即miR-199a-3p靶向作用于CABLES-1。CABLES-1是一种新型CDK (cyclin-dependent kinase)结合蛋白,位于人类染色体18q11-12,CABLES-1对于神经系统的生长具有重要作用,敲除该基因会导致细胞凋亡 [34-35] 。本文发现,下调CABLES-1的表达抑制了成骨细胞的增殖,过表达CABLES-1可以促进成骨细胞增殖。
本文证明了FSS促进成骨细胞MC3T3-E1增殖,其机制可能是通过miR-199a-3p及其靶基因CABLES-1实现。本文研究结果为FSS诱导成骨细胞增殖机制的研究提供新方向,也为未来机械刺激在骨关节疾病治疗中的临床应用研究提供新思路。
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